幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的应用基因工程方法构建表达幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的菌株．方法用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上扩增出ＵｒｅＢ基因片段，将其克隆至ｐＳＫ（＋）质粒上，然后插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达．结果经测序ＵｒｅＢ片段有１７０７ｂｐ组成，为编码５６９个氨基酸残基的多肽．ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现，ＵｒｅＢ基因表达的蛋白质分子质量为６５０００Ｕ，并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别，同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体．结论重组的ＵｒｅＢ可以作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗．

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。

中国人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的基因克隆及序列分析

目的克隆人幽门螺杆菌 (helicobacter pylori,Hp)尿素酶 B基因 (ure B) ,并分析其核苷酸序列的特性。方法用PCR技术从临床分离的 Hp菌株基因组中扩增出 ure B基因 ,将其克隆至 p HP质粒上进行序列分析。结果克隆得到的 ure B基因长度为 1713bp,其核苷酸序列与 Gen Bank公布的序列有 6 1个碱基存在差异 ,同源为 96 .44 % ,推定的氨基酸序列同源性为99.6 5 %。结论我们所克隆的 ure B基因可用于 Hp保护性抗原 Ure

大肠杆菌表达人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位跨膜区成份

目的重组表达人幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位跨膜区成份。方法采用 DNA重组技术将尿素酶 B亚单位 3'端732 bp基因片段克隆至 p ET11C载体上 ,转化宿主菌 BL 2 1(DE3) E.coli,IPTG诱导 ,SDS- PAGE及 Western- blot分析表达情况。结果成功构建了含 Ure B0 .7kb片段的重组质粒 p ET- Ure B0 .7,并表达了具有免疫反应性的分子量约 2 80 0 0 u的重组蛋白 ,表达率为 19.8%。结论重组的尿素酶 B亚单位跨膜区成份为研究其相关生物学特性奠定了重要基础 ,亦可作为 Hp疫苗的成分用于

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段的纯化及活性研究

目的建立一种有效的尿素酶功能片段的纯化方法。方法应用已构建的尿素酶B功能片段表达载体,IPTG诱导表达,包涵体鉴定试验判断目的蛋白表达形式,AKTA100上分别采用亲和层析和离子层析等多级纯化方式优化纯化条件,HPLC检测纯化蛋白纯度,尿素酶活性阻断试验对纯化后功能片段进行活性鉴定。结果IPTG诱导后目的蛋白高表达,包涵体鉴定试验证实目的蛋白以可溶形式存在宿主细胞中,优化后方案得到目的蛋白纯度>90%且能被尿素酶B免疫的兔血清识别,纯化后蛋白免疫家兔后产生兔抗血清能够特异性中和Hp尿素酶活性。结论成功建立了尿素酶功能片段的纯化方法。

BalB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫应答

目的 评价重组尿素酶B亚单位 (rUreB)作为幽门螺杆菌 (Hp)口服疫苗成份的效果、探讨Hp的免疫保护机制。方法 采用重组Hp保护性抗原UreB与粘膜免疫佐剂霍乱毒素B亚单位 (CTB)共口服免疫BalB/c小鼠 ,ELISA分析血清、唾液和粪便、胃粘液中IgG、IgA抗体水平 ,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况及IL 4、IFN γ的变化。结果 BalB/c小鼠口服rUreB和CTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。

特异性抗原幽门螺杆菌尿素酶B的体外表达

目的:建立自患者体内分离的幽门螺杆菌菌株及其抗原尿素酶B(ureB)体外表达的方法。方法:分离培养胃病患者感染的幽门螺杆菌,采用基因体外重组技术分离ureB基因,并经测序鉴定,所表达的抗原蛋白用Westernblot进行鉴定。结果:测序结果证实克隆的基因与GeneBank中的序列相符,经Westernblot证实获得ureB的重组蛋白。结论:获得了高表达的重组抗原蛋白,为ureB检测及Hp感染的诊断提供了物质基础。

茅苍术挥发油对幽门螺杆菌及其尿素酶B表达的影响

目的研究茅苍术挥发油对幽门螺杆菌(HP)的抑制作用以及亚最小抑菌浓度(sub-MIC)挥发油对HP毒力因子尿素酶B(Ure B)表达的影响。方法将实验分为阳性对照组(加入100μL HP菌悬液),溶剂对照组(加入100μL HP菌悬液和0.25μL二甲基亚砜),30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469 g·L^(-1)茅苍术组(分别加入30.000、15.000、7.500、3.750、1.875、0.938、0.469 g·L^(-1)茅苍术挥发油和100μL HP菌悬液)和空白对照组(加入培养基),运用常规肉汤稀释法测定茅苍术挥发油对HP的抑制作用。将2×1010CFU·L^(-1)HP接种于布氏肉汤液体培养基,然后分为实验组和空白对照组,实验组加入茅苍术挥发油使其终浓度为0.5×最小抑菌浓度,对照组不加茅苍术探发油,微需氧培养72 h后,采用实时定量荧光聚合酶链式反应检测2组尿素酶B(Ure B)mRNA的表达。结果溶剂对照组和0.469 g·L^(-1)茅苍术组抑制率与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。30.000、15.000、7.500、3.750、1.875 g·L^(-1)茅苍术组抑制率高于阳性对照组,0.938 g·L^(-1)茅苍术组抑制率低于阳性对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组Ure B mRNA表达量为0.036±0.001,低于对照组的0.100±0.001,差异有统计学意义(P<0.01)。结论一定浓度的茅苍术挥发油可抑制HP生长,亚抑菌浓度挥发油可下调Ure B mRNA表达。

过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防小鼠幽门螺杆菌感染

目的利用人类幽门螺杆菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防H.pylori感染的作用。方法把实验动物无特定致病菌C57BL/6小鼠分成7组,分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和尿素酶B亚单位(各100μg)加霍乱毒素(CT)(2μg)、过氧化氢酶(100μg)加CT(2μg)、尿素酶B亚单位(100μg)加CT(2μg)、PBS、单纯过氧化氢酶(100μg)、单纯尿素酶B亚单位(100μg)、单纯CT(2μg),共4次。2周后再用活H.pylori灌胃,再4周后处死动物,取胃粘膜行半定量细菌培养检查H.pylori情况。结果实验各组H.pylori完全保护率分别为:过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加CT组83.3%(20/24)、过氧化氢酶加CT组41.7%(10/24)、尿素酶B亚单位加CT组54.2%(13/24);生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯尿素酶B亚单位、单纯CT组根除率均为0%。未完全保护的小鼠,疫苗组H.pylori的定植密度明显低于其它4组(P<0.05)。此外,二价疫苗组的H.pylori完全保护率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异(P<0.05)。结论由过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫预防效果。

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因。方法提取幽门螺杆菌染色体DNA用PCR方法扩增尿素酶B基因。将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。结果分离得到了1.7kb的ureB基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基因的高效表达。在37℃诱导表达4h后,表达产物约占细菌总蛋白的34.0%。表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要是包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的55.8%。结论幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。

表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株的构建

目的采用平衡致死系统构建表达幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位的减毒沙门氏菌工程菌株。方法 PCR扩增幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位 ,与 p YA 3149(asd+ )载体质粒重组 ,转化减毒的伤寒沙门氏菌突变株 ,SDS- PAGE,用 western- blot分析其表达 ,并观察重组菌体外传代培养的稳定性。结果利用宿主 -载体平衡致死系统构建了表达幽门螺杆菌尿素酶 B亚单位的重组减毒沙门氏菌工程菌株 ,且在有选择压力的条件下在体外能稳定地繁殖、生长和传代。

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与重组基因的表达

目的：获得大量纯化的尿素酶Ｂ蛋白，为下一步的幽门螺杆菌疫苗研制作准备。方法：采用ＰＣＲ方法克隆尿素酶Ｂ基因，利用基因工程技术进行基因重组，构建表达工程菌。结果：通过对载体、培养条件的优化选择，实现了尿素酶Ｂ编码基因在大肠杆菌中的高效表达。结论：克隆到的尿素酶Ｂ编码基因和表达的蛋白，其氨基酸序列与文献报道一致。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的疫苗研究进展

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种定植在人胃和十二指肠的微需氧、革兰氏阴性、螺旋弯曲菌。H.pylori是上消化道的主要致病菌,与胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）和胃癌等疾病的发生密切相关。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

通过不同培养基、不同葡萄糖浓度、不同溶氧条件、补料与非补料对幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)基因工程菌的菌体生长与外源蛋白表达量的影响的比较 ,建立了稳定、适宜的幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因工程菌发酵工艺。多批实验结果证明 ,菌体单产可达 86 g/L ,目的蛋白的表达率为 38.2 %。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析,为H.pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEL-HP27和国际标准参考株H.pylori的ureB基因,通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中,用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1.71 kb的ureB基因片段,特异PCR可扩增出ureB基因片段,证实H.pyloriureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序,国内分离H.pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp(Genbank收录号:AY295085),编码由569个氨基酸残基组成的肽链,ureB基因序列与GenBank公布的H.pylori相应基因同源性高达96.08％-98.30％,氨基酸序列同源性在98.77％-99.82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因,其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97.67％。

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用初步纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶B免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备抗尿素酶B的mAb,用间接ELISA检测mAb的特异性和亲和力,检测mAb腹水效价,鉴定Ig亚类并测定其抗原决定簇。结果:获得8株能稳定分泌抗尿素酶B的mAb杂交瘤细胞系,这8株单抗与能产生尿素酶的小肠结肠耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌和普通变形杆菌均无交叉反应,相对亲和力为1.13×10-8～4.66×10-10,腹水mAb效价可达2×104～3.2×105。其中2株单抗属IgG1亚类,3株单抗属IgG2a亚类。8株单抗分属于3种不同的抗原决定簇。结论:获得了IgG1和IgG2a类型的针对3种不同抗原决定簇的特异性幽门螺杆菌尿素酶B的mAb,为进一步用于幽门螺杆菌的临床诊断和实验研究创造了条件。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位在大肠杆菌中的融合表达与鉴定

目的 通过对幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hipylori)尿素酶B亚单位在大肠杆菌中表达的研究,探索其免疫反应性。方法 用高保真PCR方法扩增H.pylori ureB基因,并定向克隆入pNEB193中,然后经酶切回收后插入原核表达载体pMAL-C2X进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果 特异PCR和酶切鉴定证实融合基因ureB克隆入表达载体,SDS-PAGE结果显示ureB在大肠杆菌中以融合蛋白形式MBP-ureB高效表达,约占细胞总蛋白量的26.7％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清发生特异反应。结论 成功构建了能高效表达H.pylori ureB的重组菌,为Hp基因工程疫苗的进一步研究奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位表位融合肽在大肠杆菌中的表达与纯化

构建霍乱毒素B亚单位(CTB)与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位(Ure B)表位的融合肽表达载体pET-CtUBE,在E.coliBL21(DE3)中表达融合肽CtUBE。以霍乱弧菌基因组DNA为模板,PCR扩增CTB编码序列,克隆到表达载体pET-28a,获得新质粒pET-CTB;化学合成Ure B表位编码序列,克隆到pET-CTB获得CtUBE表达载体pET-CtUBE,并转化E.coliBL21(DE3),1 mmol/L IPTG诱导融合肽表达,阴离子交换色谱柱纯化融合肽CtUBE,ELISA分析CtUBE复性结果。结果获得了表达融合肽CtUBE的工程菌,诱导后融合肽表达量占菌体总蛋白34.7%,CtUBE纯化后纯度为95.6%,复性后融合肽可与GM1神经节苷脂和抗Ure B血清结合。实验成功构建了表达Ure B表位融合肽的工程菌,融合肽CtUBE保持了CTB生物活性和反应原性,纯度符合疫苗抗原要求,可以用于抗HP感染的疫苗研制。

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位鼻腔免疫凝胶剂的研制

目的研制重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗凝胶剂,考察其特性及免疫效果。方法以卡泊波为基质,脱氧胆酸钠为黏膜吸收促进剂,制备凝胶剂,以落球法测定凝胶的黏度,SDS-PAGE电泳分析脱氧胆酸钠对蛋白纯度的影响,以免疫印记检测疫苗蛋白的完整性,以留样观察法及离心法考察凝胶的稳定性,以含抗原凝胶剂鼻腔免疫BALB/c小鼠,并与溶液剂相比较,考察凝胶剂的免疫效果。结果制备的凝胶剂稳定性好,凝胶的黏度为8050mPa.s,脱氧胆酸钠不影响蛋白的纯度,抗原蛋白的完整性良好。小鼠鼻腔免疫凝胶剂后产生了较强的特异性血清IgG及胃肠sIgA反应,优于液体免疫。结论重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位凝胶剂性质稳定,具有生物黏附性,可提高免疫效果,是较好的鼻腔免疫剂型。