尿胰蛋白酶抑制剂分离纯化研究进展

尿胰蛋白酶抑制剂(Urinary Trypsin Inhibitor,UTI)是从人类尿液中分离纯化得到的一种具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的硫酸软骨素蛋白聚糖,其对胰蛋白酶、透明质酸酶、粒细胞弹性蛋白酶、纤溶酶等蛋白酶均具有良好抑制作用,被广泛用于临床治疗急性胰腺炎和作为急性循环衰竭的抢救辅助用药。本文主要综述了尿胰蛋白酶抑制剂的来源、结构、生理功能、传统分离纯化工艺以及基因工程技术生产新方法等,旨在为尿胰蛋白酶抑制剂的高质量生产以及应用提供参考。

尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)分离纯化研究

尿胰蛋白酶抑制剂(UTI))是具有抑制胰蛋白酶作用的一类物质,可以调控生物体内多种生理反应,具有许多临床应用功能。目前,关于UTI来源、结构、功能以及它与疾病的关系都有较深入的研究,但有关其分离纯化的文献报道相对较少。文章就近年来对UTI的分离纯化研究进展予以综述。

尿胰蛋白酶抑制剂Ulinastatin对lewis肺癌小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用

目的探讨尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)在动物模型上抗肿瘤作用。方法选用尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁(Ulinastatin),Lewis肺癌小鼠模型;雄性C57BL/6小鼠40只,接种lewis肿瘤细胞,分成生理盐水组(对照组)、环磷酰胺组(CTX)、Ulinastatin2.5万单位组、Ulinastatin5万单位组、Ulinastatin10万单位组,各8只,接种后第6天,开始腹腔给药,记录皮下瘤长短径变化,做生长曲线;接种14天后处死所有小鼠,统计皮下平均瘤重和肺转移灶个数,使用流式细胞计分析凋亡率(AR)增值百分比(SPF)。结果皮下瘤重依次为(7.92±2.52、0.66±0.50、3.47±1.45、3.08±0.81、1.70±1.05)g,平均肺转移灶依次为(8.625±1.407、1.125±1.126、1.625±1.302、1.00±0.75、0.625±0.74)。CTX组(39.3±4.8)%和Ulinastatin10万单位组(40.2±3.1)%的AR值明显增加,Ulinastatin未见SPF值明显减少。结论Ulinastatin对lewis肺癌小鼠的转移瘤生长和自发性肺转移有抑制作用。

一种有效分离人尿激肽释放酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的方法

人尿激肽释放酶和人尿胰蛋白酶抑制剂是存在于尿中的酸性蛋白。本文通过ZnCl2胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的方法可有效分离两者,得率高、活性保留好。

壳聚糖多孔珠作为亲和吸附剂载体纯化人尿胰蛋白酶抑制剂

UTI粗品经壳聚糖多孔珠 胰蛋白酶亲和层析 ,得到比活为 135 0U/mg ,收率为 40 .2 %UTI组分。再经SephadexG 10 0凝胶过滤 ,发现存在四种分子形式 ,其相对分子质量分别为 6 70 0 0 ,43 0 0 0 ,2 3 0 0 0 ,16 0 0 0。其中 ,16 0 0 0的无UTI活性。

尿胰蛋白酶抑制剂生产中病毒灭活工艺的效果观察

目的验证尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)生产工艺中采用的60℃水浴10 h和乙醇处理3 h的病毒灭活效果。方法将Sindbis病毒、伪狂犬病毒(PRV)和脊髓灰质炎病毒(PV1)3种指示病毒分别加入不同的UTI原料样品中,进行60℃水浴10 h和乙醇处理3 h,处理不同时间后分别取样,用微量细胞病变法检测不同时间段样品中的病毒残留滴度。结果60℃水浴10 h可灭活(6.503±0.102)LgTCID50/mL的Sindbis病毒,灭活(6.42±0.158)LgTCID50/mL的PRV以及(6.587±0.061)LgTCID50/mL的PV1。乙醇处理3 h后可灭活(5.88±0.204)LgTCID50/mL的Sindbis病毒,灭活(6.378±0.268)LgTCID50/mL的PRV以及(5.963±0.118)LgTCID50/mL的PV1。经两种方法处理后的样品加入细胞经3代盲传均未见细胞病变(CPE)出现。结论UTI生产工艺中采用的60℃水浴10 h和乙醇处理3 h均可灭活所验证的3种指示病毒,灭活效果>6.0 LgTCID50/mL。

人尿胰蛋白酶抑制剂的快速纯化

目的以人尿浓缩物为原料 ,对人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化技术进行研究。方法利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于CNBr Sepharose 4B为亲和载体 ,在不同条件下洗脱亲和蛋白 ,可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的两种纯产物。结果层析图谱与SDS PAGE分析表明 ,根据洗脱条件 ,可将有抑制活性的 2 0kD和 40kD蛋白质分离为两个单独组份或混合物。其中 2 0kD组份的抑制活性回收为 35 % ,抑制比活为 3 387U/mg;40kD组份的相应值分别为 5 3 %和 3 116U/mg。混合物的抑制活性回收和抑制比活分别为 89%和 3 0 76U/mg ,再经Su perose 12或Superdex 75凝胶渗透层析 ,分别获得两种组份的纯产物。 结论通过选择性洗脱亲和柱 ,可快速获得高收率。

尿胰蛋白酶抑制剂对体外循环心脏手术患者血浆内毒素水平及全身炎性反应的影响

目的观察尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)对行体外循环术(CPB)患者血浆内毒素水平及全身炎性反应的影响,并评价其对脏器功能的保护作用。方法24例行CPB下心脏瓣膜置换术的患者随机分为UTI组及对照组,每组12例。UTI组患者于术中CPB转机前静滴UTI5000U/kg,术后第1～3天静脉用UTI5000U/kg,每12h一次;对照组在相同时间点静脉推注等量生理盐水。分别于术前、麻醉后主动脉阻断前、主动脉开放后及CPB术后4、8、24、48、72h等8个时间点采集患者外周静脉血,应用BET-24A内毒素分析仪检测血浆内毒素浓度,放免法检测血浆细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8浓度。在麻醉后主动脉阻断前、主动脉开放后及CPB术后4h、8h等4个时间点测定心输出量指数(CI)、每搏量指数(SI)、HR、平均动脉压(MAP)等血流动力学指标及动脉血气结果(PaO2、FiO2),根据呼吸监测指标计算肺动态及静态顺应性(Cd和Cs)、氧合指数(OI)。结果UTI组与对照组血浆内毒素浓度无显著差异(P>0.05);UTI组血浆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8浓度均低于对照组(P<0.01),CI、SI、Cs、Cd、OI均高于对照组(P<0.05),而HR、MAP与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论UTI对CPB下心脏手术患者血浆内毒素浓度无明显影响,但可显著降低血浆炎性细胞因子水平,减轻术后全身炎性反应,且对循环和呼吸功能有一定保护作用,有利于患者早期恢复。

人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

人尿经吸附剂处理，硫酸铵沉淀后，得到胰蛋白酶抑制剂（ＨＵＴＩ）粗品。粗品经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０层析及ｔｒｙｐｓｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析，得到两种ＨＵＴＩ：ＨＵＴＩ１与ＨＵＴＩ２。ＨＵＴＩ１的比活为３５５６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，活性回收率为３５％，含分子量６７０００与２５０００两种组分；ＨＵＴＩ２的比活为３３８５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，活性回收率为３１％，分子量为６７０００。经二步层析纯化，纯化因子达１１．３，而粗品直接上亲和柱所得半纯品的比活为１７０７ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，活性回收率为４２％，纯化因子５．５。

尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁抗肺癌作用研究

目的探讨尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsin inhibitor,UTI)对人肺癌细胞系A549细胞体内外抗肿瘤作用。方法选用尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁(ulinastatin),设置乌司他丁0、100、200、400U/mL四个浓度组及CTX3μg/mL阳性对照组,采用MTT比色法检测乌司他丁对A549细胞增殖抑制作用,采用侵袭小室法检测乌司他丁对A549细胞的侵袭抑制作用。建立人肺腺癌(A549)细胞裸鼠异种抑制瘤模型,设置乌司他丁0万单位、2.5万单位、5万单位组、10万单位组及CTX 0.1 g阳性对照组,通过绘制移植瘤生长曲线、统计分析瘤重和肺转移灶,检测乌司他丁对裸鼠体内肺腺癌抑制增殖和转移的作用。结果增殖抑制率分别为0%、17.82%、25.46%、42.73%、57.46%,显示乌司他丁对人肺癌细胞系A549细胞具有增殖抑制作用;侵袭指数分别为16.44%、13.06%、11.73%、7.63%、8.12%,表明乌司他丁能有效抑制人肺癌细胞系A549细胞的侵袭;瘤重抑制率分别为0%、56.19%、61.11%、68.53%、89.17%;抗肺转移率分别为0%、75.36%、85.51%、90.75%、86.94%,显示乌司他丁能有效抑制裸鼠肺癌移植瘤的生长及转移。结论乌司他丁对人肺癌细胞系A549细胞具有体内外抗肿瘤作用,该作用表现为抑制肿瘤增殖并突出表现于抑制肿瘤转移。

人尿胰蛋白酶抑制剂中间品的纯化

人尿胰蛋白酶抑制剂是一种可药用的生物制品，人尿胰蛋白酶抑制剂的粗品经过超滤，离子交换层析和亲和层析三步纯化，获得人尿胰蛋白酶抑制剂的中间品，其效价由原来的１０ｉｕ／ｍｇ纯化到２２４０ｉｕ／ｍｇ，比活为２４５０ｉｕ／ｍｇ蛋白质。活性回收率为５８％

尿胰蛋白酶抑制剂对鼠溃疡性结肠炎结肠组织中蛋白酶活性的抑制作用

目的 :确定尿胰蛋白酶抑制剂 (UTI)对鼠溃疡性结肠炎 (UC)结肠组织中蛋白酶的作用。方法 :用 18%的DNBS乙醇溶液 0 .2 5ml灌肠 ,在Wistar大鼠上建立UC模型 ;经尾静脉注射UTI ;用明胶酶谱法测定病变结肠组织中的蛋白酶活性。结果 :经UTI处理后 ,鼠UC结肠组织中蛋白酶活性仅为对照组的 1/3。结论 :UTI能显著降低鼠UC结肠组织中蛋白酶活性。

单肺麻醉期间尿胰蛋白酶抑制剂对萎陷肺保护作用的研究

目的 探讨尿胰蛋白酶抑制剂对单肺通气麻醉期间萎陷肺肺损伤的保护及作用机制.方法 选择单肺通气下食道癌开胸手术患者30例做为研究对象,ASAⅡ～Ⅲ级,随机分为对照（C组,n=15）和尿胰蛋白酶抑制剂组（U组,n=15）.尿胰蛋白酶抑制组给予尿胰蛋白酶抑制总量30万单位/100 mL在麻醉诱导后采用微量泵30 min输注完.对照组则输入100 mL生理盐水.分别于单肺通气前（T1）,单肺通气后1 h（T2）,单肺通气后2h （T3）以及手术结束（T4）4个时间点用纤维支气管镜行术侧肺叶灌洗.用ELISA法测定肺泡灌洗液中IL-6、IL-8及TNF-α含量的变化,并用瑞氏法染色进行支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞（PMN）计数.结果 与基础值T1相比,T3、T4对照组组与U组IL-6、IL-8、TNF-α含量及白细胞计数明显升高,但组间对比U组比C组升高低（P＜0.05）.结论 尿胰蛋白酶抑制剂对单肺通气期间萎陷肺的肺损伤具有一定的保护作用.

人尿胰蛋白酶抑制剂工艺研究

报道了人尿胰蛋白酶抑制剂的提取新工艺。新鲜男性尿碱化除去沉淀,调 pH 4.0,用 PolyerdeⅣ搅拌吸附,吸附剂经抽滤、洗涤、NH_4HCO_3洗脱。冼脱液经硫酸铵沉淀、透析、冻干得产品。活性回收率为60～68%,比活为515～660 u/mg。

尿胰蛋白酶抑制剂对严重脓毒症患者血清TNF-α、IL-8和IL-10水平的影响

目的探讨尿胰蛋白酶抑制剂对严重脓毒症患者血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-10(IL-10)水平的影响。方法选取86例重度脓毒症患者为研究对象,采用随机数字表法将其分为实验组(43例),对照组(43例),2组患者均给予对症治疗,实验组在此基础上给予尿胰蛋白酶抑制剂静脉注射,比较2组患者治疗前后血清TNF-α、IL-8和IL-10水平的变化。结果治疗前2组患者血清TNF-α、IL-8和IL-10水平差异无统计学意义,治疗后2组患者TNF-α、IL-8水平均显著降低(P<0.05),IL-10水平显著升高(P<0.05),实验组改善水平高于对照组(P<0.05);实验组患者总有效率为86.05%显著高于对照组65.12%(P<0.05);治疗前2组患者的APACHE-II评分与认知功能评分差异无统计学意义,治疗后APACHE-Ⅱ评分显著降低(P<0.05),实验组显著低于对照组(P<0.05),治疗后认知功能评分显著升高(P<0.05),实验组显著高于对照组(P<0.05);实验组不良反应发生率2.33%,显著低于对照组20.93%(P<0.05)。结论尿胰蛋白酶抑制剂可以有效地改善重度脓毒症患者炎症因子水平,提高总有效率,降低APACHE-II评分,改善认知功能,减少不良反应。

人尿胰蛋白酶抑制剂提取及精制工艺研究

本文研究了从已提取了尿激酶（UK）后的健康男性尿中提取及精制尿胰蛋白酶抑制剂的工艺．

人尿胰蛋白酶抑制剂与激肽释放酶联产及纯化的研究

本文探讨了采用Polyerde-3吸附剂,从男性尿中提取HUTI-HUKN粗品,再依次经抑肽酶-琼脂糖4B亲和层析、胰蛋白酶-琼脂糖4B亲和层析,将HUTI和HUKN分离并纯化。每20升尿液得精品HUTI50mg,比活1,250u/mg;HUKN3mg,比活666u/mg。活性回收率分别为41％和50％。