灵芝尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的电子克隆与生物信息学分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是灵芝多糖合成途径的关键酶,用电子克隆方法得到灵芝UGPase基因,并利用生物信息学软件对UGPase基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、蛋白结构域、蛋白高级结构以及系统进化树的构建等方面进行了预测和分析。结果表明:UGPase基因全长1691 bp,包含一个1515 bp的完整开放阅读框,编码504个氨基酸;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,它是定位于细胞质内的一种亲水性稳定蛋白酶;它的高级结构主要是由α螺旋结构和无规则卷曲结构所组成;同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列和其他动植物的UGPase酶相比在序列组成、高级结构方面具有一定的相似性。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因调控不同地源灵芝孢子粉次生代谢产物的差异

目的探讨不同地源灵芝孢子粉携带尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因在转录水平上的差异表达,以及对灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP)含量的影响.方法采集不同地源灵芝孢子粉共7批18份,通过水浸煮-醇沉法提取GLP,应用苯酚-硫酸法计算GLP含量.克隆、测序UGPase基因,荧光定量PCR检测UGPase-mRNA.结果灵芝孢子粉GLP检测结果显示:吉林产含量为(3.3610±0.0046)%,云南产含量为(2.8870±0.0059)%,××堂孢子粉含量为(2.3990±0.0053)%,差异具有统计学意义(P<0.05);克隆UGPase基因测序结果显示:不同地域灵芝孢子粉携带UGPase基因序列相同,与Genbank中UGPase基因序列(Sequence:KM260167.1)核苷酸同源性达100%.UGPase-mRNA检测结果显示:吉林产灵芝孢子粉为表达量最高.结论不同地源灵芝孢子粉GLP与UGPase-mRNA相对表达量存在差异.UGPase基因在高多糖灵芝菌株中存在明显的表达优势,与GLP的生物合成呈正相关,该机制为深入研究GLP的生物合成提供了理论依据.

Apocynaceae系细胞尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的纯化和表征

经 4步分离纯化的Apocynaceae植物培养细胞尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)的比活为 2 0 4 9U mg ,与细胞粗提液相比 ,活力提高 97倍 ,活力回收率为 2 1 %,可直接用于尿苷二磷酸葡萄糖 (UDPG)的合成 ,并且储存稳定性很好 .UGPase的最适pH值为 7 2 ,UGPase的最适温度为 37℃左右 .Mg2 + 是UGPase发挥活力所必需的 .高浓度UTP和Glc 6

小麦腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶同工酶基因型与酶活性及淀粉含量的关系

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定了我国60个代表性小麦品种的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)同工酶基因型,并测定了AGP活性及总淀粉含量,以明确小麦籽粒AGP同工酶基因型组成及其与AGP活性和淀粉含量的关系。结果表明,AGP有AGPa、AGPb、AGPc和AGPd4个等位基因位点,其出现频率分别为96.7%、80.0%、86.7%和16.7%;共检测到5种基因型,其中基因型AGPabc出现频率最高,为46.7%。不同基因型的品种间AGP活性和总淀粉含量差异显著(P<0.05)。其中具有基因型AGPabcd的品种酶活性及总淀粉含量最高,表明小麦籽粒中不同AGP同工酶基因型对酶活性及淀粉含量有不同遗传效应。

抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定

本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2(UDP-glucose pyrophosphorylase2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白,用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特性鉴定,通过Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗体特异性。结果表明:通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人UGP2mAb的杂交瘤细胞系BAD062,其分泌的单克隆抗体的Ig亚类(型)为IgG2b(κ),Western blot结果显示该抗体可以特异地识别分子量为56kD的蛋白;应用单克隆抗体BAD062对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAPXR)进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为UGP2。结论:单克隆抗体BAD062特异地识别抗原UGP2,该抗体可用于ELISA检测、Western blot、免疫组织化学实验,为UGP2的研究提供了有力的工具。

白花泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶mRNA全序列克隆及序列分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose Pyrophosphorylase UGPase)是白花泡桐(Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl.)纤维素特异途径的关键酶.在经过对其他物种UGP mRNA序列的对比分析后,设计保守区简并引物,首先用RT-PCR方法得到413 bp UGP mRNA部分序列,之后通过RACE方法,成功克隆得到包括5’UTR和3’UTR在内的UGP全部mRNA序列,并进行了分析,所得UGP mRNA全序列共1 694个碱基,CDS共1 428个碱基(112-1539),编码氨基酸475,和其他多个物种的UGP序列比对结果显示相似度均在80%以上.

马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的调控

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成过程中一个限速酶 ,其表达受到转录、温度、底物等多种因素调控。在 2 5℃其活性最强。 3 磷酸甘油和焦磷酸分别是其最有效的激活剂和抑制剂 ,其它物质如BSA、半胱氨酸、 2 巯基乙醇和谷胱甘肽都能使腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性有所提高 ;NADP +、ADP、AMP等轻微地抑制腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性。

铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的密码子偏好性分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose pyrophosphorylase,UGPase)是糖代谢的主要酶类之一.为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的密码子使用特性,运用CHIPS、CUSP和CodonW在线程序分析自主克隆的铁皮石斛UGP基因(GenBank登录号:KF711982.1)的密码子偏好性,并与其他物种的UGP基因以及基因组进行比较.结果显示,铁皮石斛UGP基因偏好使用A/T结尾的密码子,27种偏好密码子(RSCU>1)中偏好性较强的有TAA和CCU(RSCU≥2).与其他物种的UGP基因密码子使用对比后,发现不同物种UGP基因密码子使用偏好性存在一定差异.在9个所选物种的聚类分析中,发现基于UGP基因CDS序列聚类的进化树比基于RSCU的聚类更与传统的系统发育观点接近.与3种生物基因组密码子使用频率比较发现,与大肠杆菌基因组密码子使用频率差值较大的有23个,与酵母和拟南芥基因组差值较大的均有13个,这预示着铁皮石斛UGP基因在酵母和拟南芥中的表达效率较高.本研究结果为铁皮石斛UGP基因选择最佳的外源表达系统以及提高其表达水平奠定了前期的研究基础.

铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与分析

目的:研究尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)在铁皮石斛不同组织中的表达情况,探讨其与石斛多糖累积的关系。方法:根据铁皮石斛原球茎转录组数据中的DoUGPase1序列设计引物,并利用RACE技术克隆该基因;用生信分析软件预测其蛋白结构,并进行系统发育分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究该基因在铁皮石斛不同年份,不同组织中的表达。结果:通过RACE技术得到1个3054 bp基因,命名为DoUGPase1,其ORF长1530 bp,编码510个氨基酸残基,与油棕(Elaeis guineensis)和波斯枣(Phoenix dactylifera)有一定的同源性,且DoUGPase1在3年生的植株中相对表达量整体较高(P<0.05)。结论:我们预测在铁皮石斛的生长发育过程中DoUGPase1基因与多糖累积的活跃程度成正比例。

反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析

构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因和4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)反义基因的双价基因植物表达载体,用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404中,并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern杂交结果证实,双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤维素和硫酸木质素含量测定结果显示,转基因烟草纤维素含量增加,木质素含量减少,表明双价基因能够有效表达。

OsUgp2和otsAB基因共转化增强水稻抗旱抗寒能力

本研究通过农杆菌介导的转化技术,将水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(OsUgp2)与大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶/海藻糖-6-磷酸合成酶磷脂酶融合基因(otsAB)共表达载体转化水稻愈伤组织,对获得的转基因植株分别进行干旱和寒冷处理,试图明确OsUgp2和otsAB共表达是否可以进一步提高转基因水稻植株的抗胁迫能力。表型观察结果显示OsUgp2和otsAB共表达植株(ABU)经干旱和寒冷处理后恢复生长的能力,较otsAB和OsUgp2分别过量表达的转化植株(AB和U)均有所提高。定量PCR检测结果显示:经干旱处理后,转化植株ABU中otsAB和OsUgp2的表达量较未处理植株分别提高1.92倍和1.67倍,与转化植株AB和U中otsAB和OsUgp2表达的增加量相近;而寒冷处理后,转化植株ABU中otsAB和Os-Ugp2的表达量分别增加2.68倍和2.04倍,明显高于转化植株AB和U中otsAB和OsUgp2表达的增加量。液相色谱检测结果显示:OsUgp2和otsAB共表达和单表达均可以提高转化植株中海藻糖的生物合成量,且共转化植株ABU中海藻糖的含量在干旱和寒冷处理前后均是最高的。干旱和寒冷处理后,共转化植株ABU中蔗糖含量的增加也较明显。本研究结果表明OsUgp2和otsAB共表达可以增加转基因水稻植株中海藻糖和蔗糖分子的含量,同时转基因水稻植株的抗旱和耐冷胁迫的能力也得到了一定提高。

UGP2基因与肿瘤关系的研究进展

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP2)在糖代谢特别是糖原生物合成过程中起重要作用,其将葡萄糖部分从1磷酸葡萄糖转移到MgUTP,生成UDP葡萄糖并释放焦磷酸盐PPi。研究表明,UGP2基因与多种肿瘤关系密切。本文对UGP2基因与肿瘤的关系研究进展做一综述。

农杆菌介导glgC-TM基因转化水稻研究

利用农杆菌介导将 glg C- TM基因导入多个水稻品种。研究表明农杆菌转化过程中 ,潮霉素是一种很好的筛选剂 ,成熟胚以及国产的羧苄青霉素不适宜用作农杆菌介导的遗传转化。不同品种以及不同的质粒在转化过程中对抗性愈伤的得率和阳性植株的转化率不存在显著影响。 T1 代 PCR检测表明 ,在转基因当代就有可能获得转基因纯系。

小麦胚乳淀粉合成酶基因研究进展

很多研究表明,小麦胚乳淀粉的合成至少需要四类酶——腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶,这四类酶的基因克隆和特性的研究有重要进展。目前,已从六倍体小麦发育胚乳的cDNA文库中获得AGPase两个亚基、gbss 、ss 、ss 、ss 、sbe 、sbe 和su1(dbe)等基因的cDNA;从六倍体小麦的D组供体Triticumtauschii基因组文库中获得ss 、ss 、ss 、sbe 和sbe 的gDNAs;从六倍体中只获得野生型和突变型的gbss (wx)基因。除编码AGPase大亚基的基因和su1基因未进行定位外,ss 位于第一群染色体上,sbe 位于2DL上,其余基因均位于第七群染色体上。

UGPase和反义4CL基因对转基因烟草纤维素和木质素合成的调控

用根癌农杆菌介导法将源于紫穗槐的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因、反义4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因以及两者的双价基因分别转移至烟草中。PCR和Southern杂交检测证实外源基因已整合到转基因烟草基因组中。测定全纤维素和Klason木质素含量的结果显示,增强UGPase基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量,但对木质素含量没有影响;抑制4CL基因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量,但对纤维素含量没有影响;转移双价基因的转基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。

外源糖对水稻Ugp1基因表达调控研究

植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是蔗糖合成与降解途径的关键酶。本研究采用水稻叶片离体培养方法,结合Northern杂交技术,研究了外源糖对水稻Ugp1基因表达的影响。研究结果表明,蔗糖、葡萄糖、果糖、光照均能上调水稻Ugp1基因的表达,同时这种上调表达依赖于己糖激酶;果糖能上调水稻成熟叶片中Ugp1基因的表达,但并不影响苗期叶片中Ugp1基因的表达,具组织特异性;葡萄糖和果糖协同作用对Ugp1基因的诱导表达强于蔗糖,这种诱导除依赖于己糖激酶外,还存在其它未知的调控途径。水稻中存在UGPase的多种异构体,蔗糖及光照可诱导水稻Ugp1基因的上调表达,但对水稻UGPase的多种异构体形式并无影响。研究结果将有助于深入了解水稻Ugp1基因与糖信号途径互作调控网络。

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

【目的】克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据。【方法】根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列。运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析。【结果】克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566bp,其中包括1566bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽。其理论蛋白质分子量57.01kDa,等电点6.1,呈酸性。多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87%、87%和86%。结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性。蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角。【结论】木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性。

用启动子融合GUS的方法分析OsUgp1基因的表达模式

克隆水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（OsUgp1）的启动子,并与大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucu-ron idase,GUS）报告基因连接后转化水稻,采用GUS组织化学染色检测启动子驱动GUS基因在水稻转化植株中的表达情况,发现在水稻的根、茎、叶、内外稃、子房、柱头等组织,以及减数分裂时期的花药及不同发育时期的胚乳和胚中均有表达.通过与水稻中另一同源基因（OsUgp2）的启动子GUS融合基因在种子发育过程的表达进行比较,发现两者有明显的差异：OsUgp1基因在开花后5-20 d的胚乳和胚中表达量都比较高,而OsUgp2基因几乎不表达.进一步通过对OsUgp1基因和OsUgp2基因启动子区有关胚乳特异表达相关顺式调控元件在数量和分布位置上的差异分析,探讨了该2个同源基因在种子发育中趋异表达可能的分子机制.

不同小麦品种籽粒淀粉组分及相关酶活性的差异

根据小麦成熟期籽粒淀粉组分的差异 ,用聚类分析的方法 ,将籽粒总淀粉含量相近、直链淀粉和支链淀粉含量存在差异的 9个小麦品种分为 3组 :低直链淀粉组、中直链淀粉组和高直链淀粉组。研究籽粒灌浆过程中 ,直链淀粉与支链淀粉比值 (直 /支比值 )的变化动态、淀粉合成相关酶活性的变化动态及其与淀粉组分积累的关系。结果表明 :高直链淀粉组的直 /支比值在花后 2 8d和 35d显著高于低直链淀粉组和中直链淀粉组 ,说明不同小麦品种直 /支比值的差异是灌浆中后期直链淀粉与支链淀粉积累速率的不同所致。在灌浆期 ,籽粒中淀粉粒结合淀粉合成酶 (GBSS)活性较低 ,同时灌浆中后期 ,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (ADPGPPase)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDPGPPase)活性较低的品种(低直链淀粉组 ) ,籽粒直链淀粉含量较低。籽粒中较高的可溶性淀粉合成酶 (SSS)活性 ,在灌浆前期有利于直链淀粉和支链淀粉的积累 ,而在灌浆后期 ,则有利于支链淀粉的积累 ,不利于直链淀粉的积累。

木薯AGPase基因家族的生物信息学及其表达分析

【目的】搜索鉴定木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的基因家族成员,并分析其生物学信息及不同组织和非生物胁迫下的表达情况,为木薯AGPase基因的功能挖掘及淀粉性状遗传改良提供理论依据。【方法】从木薯基因组数据库(Phytozome)下载木薯全基因组序列,从中筛选含NTP_transferase(Pfam编号PF00483)保守结构域序列的AGPase基因家族成员,利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析。基于NCBI转录组测序(RNA-seq)数据,对木薯AGPase基因家族成员在不同组织及冷害和干旱胁迫下的表达模式进行分析。【结果】从木薯全基因组序列中共鉴定出9个AGPase基因家族成员,包含6个AGPase大亚基(LS)基因和3个小亚基(SS)基因。6个LS基因在长度和编码氨基酸数目上差异明显,但3个SS基因间的差异不明显。LS基因外显子数目为8～15个,SS基因外显子数目均为9个。9个木薯AGPase基因家族成员分布于8条染色体和1个scalefold中,未在染色体上发现串联成簇分布现象。木薯AGPase基因家族启动子区域含有多个干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件及多种除干旱外的其他非生物胁迫响应元件。9个AGPase基因家族成员在不同木薯组织间的表达模式具有组织特异性。经冷害胁迫后,除MeAGL1.3基因外,其余8个基因表达量均极显著(P<0.01,下同)或显著(P<0.05,下同)下调;经干旱胁迫后,MeAGL1.4、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因表达量极显著或显著下调,MeAGL1.3基因的表达量显著上调,其余基因与对照无显著差异(P>0.05)。【结论】木薯AGPase基因家族成员具有保守的基因结构和功能结构域,其表达具有组织特异性,大多数成员表达水平受冷害和干旱胁迫调控。