RNA的尿苷化

很多RNA分子可以进行转录后修饰.最近的研究发现,末端无需模板的尿苷酸添加(尿苷化)可能就是一种广泛存在且保守,但以前了解甚少的RNA转录后修饰方式.这种修饰可以发生在从藻类到人类的很多RNA上,如多聚腺苷化的mRNA、siRNAs或miRNAs内切mRNA得到的上游片段、组蛋白mRNA、目前发现的大多数小调节RNAs、U6小核RNA(snRNA)、转录起点相关的小RNA和剪切的内含子等.这种修饰不仅具有重要的功能,如增强RNA的降解、促进或抑制RNA的加工形成、改变RNA的活性或作为mRNA的一种质量控制机制,而且还与人类的一些致病机制有关,如癌症.本文主要综述了小RNA、mRNA及其内切片段、组蛋白mRNA和U6 snRNA等RNA尿苷化的研究进展,并对相关研究的应用前景做了展望.

微小RNAs的3'端尿苷化和腺苷化

miRNA是转录后基因表达调节的重要分子,但目前对它们自身的调节机制还知之甚少.最近的研究发现,在很多生物中,miRNA的3'末端都可以无需模板的添加尿苷酸(尿苷化)或腺苷酸(腺苷化),这种修饰可以发生在miRNA的前体上,也可以发生在成熟的miRNA上,其作用不仅可以影响miRNA的生物合成,稳定性,靶向靶标mRNAs的效率,而且还可以作为损伤miRNA的质量控制机制,及其形成mRNAs的异构体,以提高miRNA的作用范围或更精细的发挥基因表达调节作用.越来越多的研究揭示:这种修饰具有miRNA、组织、生物发育阶段和疾病状况等特异性,而且还涉及很多人类的发病机制,如癌症.本文综述了miRNA的3'末端尿苷化或腺苷化的研究进展,并对这种机制的应用前景进行了展望.

灵芝尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的电子克隆与生物信息学分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是灵芝多糖合成途径的关键酶,用电子克隆方法得到灵芝UGPase基因,并利用生物信息学软件对UGPase基因编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、蛋白结构域、蛋白高级结构以及系统进化树的构建等方面进行了预测和分析。结果表明:UGPase基因全长1691 bp,包含一个1515 bp的完整开放阅读框,编码504个氨基酸;该蛋白不存在信号肽和跨膜结构域,它是定位于细胞质内的一种亲水性稳定蛋白酶;它的高级结构主要是由α螺旋结构和无规则卷曲结构所组成;同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列和其他动植物的UGPase酶相比在序列组成、高级结构方面具有一定的相似性。

Apocynaceae系细胞尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的纯化和表征

经 4步分离纯化的Apocynaceae植物培养细胞尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)的比活为 2 0 4 9U mg ,与细胞粗提液相比 ,活力提高 97倍 ,活力回收率为 2 1 %,可直接用于尿苷二磷酸葡萄糖 (UDPG)的合成 ,并且储存稳定性很好 .UGPase的最适pH值为 7 2 ,UGPase的最适温度为 37℃左右 .Mg2 + 是UGPase发挥活力所必需的 .高浓度UTP和Glc 6

尿苷基转移酶通过调节miR132/212簇的尿苷化影响食管上皮细胞放射敏感性

目的验证末端尿苷基转移酶(TUT4)通过影响miR132/212簇的尿苷化作用影响食管上皮细胞(HEEC)的放射敏感性。方法本研究通过PCR的方法检测0、2、4、6和8 Gy X射线照射后0、6、18、24和48 h HEEC中TUT4的表达。将细胞分为阴性对照组、下调TUT4表达组(shTUT4组)、单纯6 Gy照射组(6 Gy组)、6 Gy照射+下调TUT4表达组(6 Gy+shTUT4组)分别检测TUT4对细胞放射敏感性、细胞增殖、细胞周期、线粒体损伤、氧自由基产生的影响;通过PCR检测下调TUT4表达对miR132/212尿苷化的影响;克隆形成和增殖实验检测过表达miR132/212及miR132/212+UUU(末端添加3个尿嘧啶的miR132/212)时HEEC的放射敏感性;增殖实验检测在下调TUT4表达且过表达miR132/212及尿苷化miR132/212时HEEC的增殖情况。结果PCR结果显示,2、4、6和8 Gy X射线照射后TUT4表达增加,差异有统计学意义(t=12.84、62.06、27.86、32.43,P<0.05)。下调TUT4表达可增加HEEC的放射敏感性,D0、Dq、SF2值分别为0.79、1.61、0.47,与对照组比较差异有统计学意义(t=13.2、5.85、7.31,P<0.05),放射增敏比(SER_(D0))为1.41;且经6 Gy照射后,低表达TUT4组细胞增殖减少(t=7.12、13.63,P<0.05)、S期细胞增加(t=11.98,P<0.05)、线粒体损伤增加(t=11.98,P<0.05)、氧自由基产生增加(t=15.65,P<0.05)。进一步研究结果表明,下调TUT4表达可使miR132/212表达增加,miR132/212+UUU表达减少(t=27.90、60.99,P<0.05);而过表达miR132/212和miR132/212+UUU也可影响HEEC的放射敏感性,SER_(D0)分别为1.20、0.71。双重转染实验证明,TUT4低表达且miR132/212过表达细胞的增殖能力较单纯TUT4低表达时更弱(t=4.76、7.65,P<0.05);同时TUT4低表达且过表达miR132/212+UUU时细胞增殖能力较单纯TUT4低表达更强,差异有统计学意义(t=7.22,P<0.05)。结论X射线可增加HEEC中TUT4的表达,TUT4可降低HEEC放射敏感性、减轻放射损伤,其机制与miR132/212的尿苷化相关。

抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定

本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2(UDP-glucose pyrophosphorylase2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白,用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特性鉴定,通过Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗体特异性。结果表明:通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人UGP2mAb的杂交瘤细胞系BAD062,其分泌的单克隆抗体的Ig亚类(型)为IgG2b(κ),Western blot结果显示该抗体可以特异地识别分子量为56kD的蛋白;应用单克隆抗体BAD062对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAPXR)进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为UGP2。结论:单克隆抗体BAD062特异地识别抗原UGP2,该抗体可用于ELISA检测、Western blot、免疫组织化学实验,为UGP2的研究提供了有力的工具。

白花泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶mRNA全序列克隆及序列分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose Pyrophosphorylase UGPase)是白花泡桐(Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl.)纤维素特异途径的关键酶.在经过对其他物种UGP mRNA序列的对比分析后,设计保守区简并引物,首先用RT-PCR方法得到413 bp UGP mRNA部分序列,之后通过RACE方法,成功克隆得到包括5’UTR和3’UTR在内的UGP全部mRNA序列,并进行了分析,所得UGP mRNA全序列共1 694个碱基,CDS共1 428个碱基(112-1539),编码氨基酸475,和其他多个物种的UGP序列比对结果显示相似度均在80%以上.

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因调控不同地源灵芝孢子粉次生代谢产物的差异

目的探讨不同地源灵芝孢子粉携带尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因在转录水平上的差异表达,以及对灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP)含量的影响.方法采集不同地源灵芝孢子粉共7批18份,通过水浸煮-醇沉法提取GLP,应用苯酚-硫酸法计算GLP含量.克隆、测序UGPase基因,荧光定量PCR检测UGPase-mRNA.结果灵芝孢子粉GLP检测结果显示:吉林产含量为(3.3610±0.0046)%,云南产含量为(2.8870±0.0059)%,××堂孢子粉含量为(2.3990±0.0053)%,差异具有统计学意义(P<0.05);克隆UGPase基因测序结果显示:不同地域灵芝孢子粉携带UGPase基因序列相同,与Genbank中UGPase基因序列(Sequence:KM260167.1)核苷酸同源性达100%.UGPase-mRNA检测结果显示:吉林产灵芝孢子粉为表达量最高.结论不同地源灵芝孢子粉GLP与UGPase-mRNA相对表达量存在差异.UGPase基因在高多糖灵芝菌株中存在明显的表达优势,与GLP的生物合成呈正相关,该机制为深入研究GLP的生物合成提供了理论依据.

反义4CL与UGPase双价基因在烟草中的转化及表达分析

构建了携带紫穗槐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase,UGPase)基因和4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)反义基因的双价基因植物表达载体,用热激法转化至根癌农杆菌LBA4404中,并用制备的农杆菌工程菌进行了烟草转化。PCR及Southern杂交结果证实,双价基因已成功整合到烟草基因组中。综纤维素和硫酸木质素含量测定结果显示,转基因烟草纤维素含量增加,木质素含量减少,表明双价基因能够有效表达。

OsUgp2和otsAB基因共转化增强水稻抗旱抗寒能力

本研究通过农杆菌介导的转化技术,将水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(OsUgp2)与大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶/海藻糖-6-磷酸合成酶磷脂酶融合基因(otsAB)共表达载体转化水稻愈伤组织,对获得的转基因植株分别进行干旱和寒冷处理,试图明确OsUgp2和otsAB共表达是否可以进一步提高转基因水稻植株的抗胁迫能力。表型观察结果显示OsUgp2和otsAB共表达植株(ABU)经干旱和寒冷处理后恢复生长的能力,较otsAB和OsUgp2分别过量表达的转化植株(AB和U)均有所提高。定量PCR检测结果显示:经干旱处理后,转化植株ABU中otsAB和OsUgp2的表达量较未处理植株分别提高1.92倍和1.67倍,与转化植株AB和U中otsAB和OsUgp2表达的增加量相近;而寒冷处理后,转化植株ABU中otsAB和Os-Ugp2的表达量分别增加2.68倍和2.04倍,明显高于转化植株AB和U中otsAB和OsUgp2表达的增加量。液相色谱检测结果显示:OsUgp2和otsAB共表达和单表达均可以提高转化植株中海藻糖的生物合成量,且共转化植株ABU中海藻糖的含量在干旱和寒冷处理前后均是最高的。干旱和寒冷处理后,共转化植株ABU中蔗糖含量的增加也较明显。本研究结果表明OsUgp2和otsAB共表达可以增加转基因水稻植株中海藻糖和蔗糖分子的含量,同时转基因水稻植株的抗旱和耐冷胁迫的能力也得到了一定提高。

植物尿苷二磷酸糖焦磷酸化酶研究进展

尿苷二磷酸糖焦磷酸化酶(UDP-sugar-producing pyrophosphorylase)是糖代谢过程中的一类重要酶,负责催化尿苷二磷酸糖(UDP-sugar)的合成与代谢。本研究综述了3种类型植物UDP-糖焦磷酸化酶在进化关系、结构特性、蛋白定位、寡聚化方式以及生理功能等方面的研究进展,为进一步明确UDP-糖焦磷酸化酶的相关性质及其在植物糖代谢过程中的重要作用提供依据。

铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与分析

目的:研究尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)在铁皮石斛不同组织中的表达情况,探讨其与石斛多糖累积的关系。方法:根据铁皮石斛原球茎转录组数据中的DoUGPase1序列设计引物,并利用RACE技术克隆该基因;用生信分析软件预测其蛋白结构,并进行系统发育分析;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究该基因在铁皮石斛不同年份,不同组织中的表达。结果:通过RACE技术得到1个3054 bp基因,命名为DoUGPase1,其ORF长1530 bp,编码510个氨基酸残基,与油棕(Elaeis guineensis)和波斯枣(Phoenix dactylifera)有一定的同源性,且DoUGPase1在3年生的植株中相对表达量整体较高(P<0.05)。结论:我们预测在铁皮石斛的生长发育过程中DoUGPase1基因与多糖累积的活跃程度成正比例。

铁皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的密码子偏好性分析

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-Glucose pyrophosphorylase,UGPase)是糖代谢的主要酶类之一.为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的密码子使用特性,运用CHIPS、CUSP和CodonW在线程序分析自主克隆的铁皮石斛UGP基因(GenBank登录号:KF711982.1)的密码子偏好性,并与其他物种的UGP基因以及基因组进行比较.结果显示,铁皮石斛UGP基因偏好使用A/T结尾的密码子,27种偏好密码子(RSCU>1)中偏好性较强的有TAA和CCU(RSCU≥2).与其他物种的UGP基因密码子使用对比后,发现不同物种UGP基因密码子使用偏好性存在一定差异.在9个所选物种的聚类分析中,发现基于UGP基因CDS序列聚类的进化树比基于RSCU的聚类更与传统的系统发育观点接近.与3种生物基因组密码子使用频率比较发现,与大肠杆菌基因组密码子使用频率差值较大的有23个,与酵母和拟南芥基因组差值较大的均有13个,这预示着铁皮石斛UGP基因在酵母和拟南芥中的表达效率较高.本研究结果为铁皮石斛UGP基因选择最佳的外源表达系统以及提高其表达水平奠定了前期的研究基础.

UGP2基因与肿瘤关系的研究进展

UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP2)在糖代谢特别是糖原生物合成过程中起重要作用,其将葡萄糖部分从1磷酸葡萄糖转移到MgUTP,生成UDP葡萄糖并释放焦磷酸盐PPi。研究表明,UGP2基因与多种肿瘤关系密切。本文对UGP2基因与肿瘤的关系研究进展做一综述。

外源糖对水稻Ugp1基因表达调控研究

植物尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)是蔗糖合成与降解途径的关键酶。本研究采用水稻叶片离体培养方法,结合Northern杂交技术,研究了外源糖对水稻Ugp1基因表达的影响。研究结果表明,蔗糖、葡萄糖、果糖、光照均能上调水稻Ugp1基因的表达,同时这种上调表达依赖于己糖激酶;果糖能上调水稻成熟叶片中Ugp1基因的表达,但并不影响苗期叶片中Ugp1基因的表达,具组织特异性;葡萄糖和果糖协同作用对Ugp1基因的诱导表达强于蔗糖,这种诱导除依赖于己糖激酶外,还存在其它未知的调控途径。水稻中存在UGPase的多种异构体,蔗糖及光照可诱导水稻Ugp1基因的上调表达,但对水稻UGPase的多种异构体形式并无影响。研究结果将有助于深入了解水稻Ugp1基因与糖信号途径互作调控网络。

UGPase和反义4CL基因对转基因烟草纤维素和木质素合成的调控

用根癌农杆菌介导法将源于紫穗槐的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因、反义4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)基因以及两者的双价基因分别转移至烟草中。PCR和Southern杂交检测证实外源基因已整合到转基因烟草基因组中。测定全纤维素和Klason木质素含量的结果显示,增强UGPase基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量,但对木质素含量没有影响;抑制4CL基因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量,但对纤维素含量没有影响;转移双价基因的转基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。

不同小麦品种籽粒淀粉组分及相关酶活性的差异

根据小麦成熟期籽粒淀粉组分的差异 ,用聚类分析的方法 ,将籽粒总淀粉含量相近、直链淀粉和支链淀粉含量存在差异的 9个小麦品种分为 3组 :低直链淀粉组、中直链淀粉组和高直链淀粉组。研究籽粒灌浆过程中 ,直链淀粉与支链淀粉比值 (直 /支比值 )的变化动态、淀粉合成相关酶活性的变化动态及其与淀粉组分积累的关系。结果表明 :高直链淀粉组的直 /支比值在花后 2 8d和 35d显著高于低直链淀粉组和中直链淀粉组 ,说明不同小麦品种直 /支比值的差异是灌浆中后期直链淀粉与支链淀粉积累速率的不同所致。在灌浆期 ,籽粒中淀粉粒结合淀粉合成酶 (GBSS)活性较低 ,同时灌浆中后期 ,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (ADPGPPase)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDPGPPase)活性较低的品种(低直链淀粉组 ) ,籽粒直链淀粉含量较低。籽粒中较高的可溶性淀粉合成酶 (SSS)活性 ,在灌浆前期有利于直链淀粉和支链淀粉的积累 ,而在灌浆后期 ,则有利于支链淀粉的积累 ,不利于直链淀粉的积累。

植物中的糖代谢及其相关酶

概述了糖在植物代谢、生长、发育中的作用 ,总结了糖代谢相关反应及相关的酶 :如尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶、转化酶、己糖激酶的亚细胞定位 ,酶学特性。论述了通过转基因等手段探知的这些相关酶的生物学作用。

灵芝细胞中异源表达透明颤菌血红蛋白基因提高胞外多糖的产量

在灵芝(Ganoderma lingzhi)中异源表达透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)基因,采用一氧化碳差异波谱分析的方法检测转基因菌株的生物活性,并对野生型菌株和工程菌株进行发酵,通过荧光定量PCR对灵芝多糖生物合成途径上的葡萄糖磷酸变位酶(α-phosphoglucomutase,PGM)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate glucose pyrophosphorylase,UGP)和β-1,3-葡聚糖合酶(β-1,3-glucan synthase,GLS)3个基因的转录水平进行分析。研究表明:透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)在灵芝中能够成功表达,并且具有生物活性;工程菌株中胞外多糖的最高产量达0.83g/L,比野生型菌株提高了88.6%;与野生型菌株相比,工程菌株中多糖生物合成途径上PGM、UGP和GLS基因的相对表达量分别是1.52、1.55和3.85。异源表达透明颤菌血红蛋白基因是提高灵芝胞外多糖产量的一种有效方法。

用启动子融合GUS的方法分析OsUgp1基因的表达模式

克隆水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（OsUgp1）的启动子,并与大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucu-ron idase,GUS）报告基因连接后转化水稻,采用GUS组织化学染色检测启动子驱动GUS基因在水稻转化植株中的表达情况,发现在水稻的根、茎、叶、内外稃、子房、柱头等组织,以及减数分裂时期的花药及不同发育时期的胚乳和胚中均有表达.通过与水稻中另一同源基因（OsUgp2）的启动子GUS融合基因在种子发育过程的表达进行比较,发现两者有明显的差异：OsUgp1基因在开花后5-20 d的胚乳和胚中表达量都比较高,而OsUgp2基因几乎不表达.进一步通过对OsUgp1基因和OsUgp2基因启动子区有关胚乳特异表达相关顺式调控元件在数量和分布位置上的差异分析,探讨了该2个同源基因在种子发育中趋异表达可能的分子机制.