尿路感染细胞实验中庆大霉素对尿路致病大肠杆菌的杀伤作用及细胞毒性研究

目的在尿路感染体外细胞实验中,比较不同浓度庆大霉素(0、10、20、50、100、200μg/mL)对尿路致病大肠杆菌(UPEC)的杀伤作用,对尿路上皮细胞及炎性细胞如巨噬细胞的毒性作用。方法比较不同浓度庆大霉素对不同量UPEC J96菌株(10^(8)、10^(7)、10^(6))的杀伤情况;CCK-8实验检测不同浓度庆大霉素在不同时间内(2 h或24 h)对原代培养的C57BL/6雄鼠肾小管上皮细胞、腹腔巨噬细胞、人膀胱上皮细胞系J82的毒性作用;根据实验选择合适的庆大霉素浓度和作用时间,检测J96对小鼠肾小管上皮细胞的黏附、入侵以及小鼠巨噬细胞对J96的吞噬、清除作用。结果庆大霉素(≥10μg/mL)对J96的杀伤作用均强于1%的青霉素/链霉素双抗(P<0.0001),高浓度庆大霉素(≥100μg/mL)可在30 min内完全杀伤高达10^(8)的J96。50μg/mL庆大霉素作用2 h可对人膀胱上皮细胞系J82产生毒性作用(P<0.05)。结论本文明确了不同细胞体外实验时适宜的庆大霉素处理浓度及时间,人膀胱上皮细胞系J82对庆大霉素更为敏感。

尿路致病性大肠杆菌与宿主相互作用的研究进展

泌尿系感染(UTI)是泌尿外科常见的感染性疾病,通常由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)引起。UPEC入侵及定殖于尿路上皮细胞,造成泌尿系感染以及复杂的宿主免疫清除和病原体免疫逃逸,包括物理屏障的防御、中性粒细胞迁移、募集和吞噬以及细胞因子的分泌等。病原体与宿主之间复杂的免疫反应与免疫逃避是疾病发生发展的关键,也是UTI治疗的基础。本文针对最新的UTI中宿主-尿路致病大肠杆菌相互作用作一综述。

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH和fimC基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建以尿路致病性大肠杆菌(UPEC)Ⅰ型菌毛编码基因fimH和fimC为目的基因的原核重组表达质粒,诱导其在E.coliBL-21中表达,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自UPEC标准菌株J96获取fimH和fimC基因,分别插入原核表达载体pGEX-4T-2;将重组表达质粒转染感受态E.coliBL-21,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE和Westernblot鉴定并纯化目的蛋白fimH和fimC蛋白,定量后免疫BALB/c小鼠,动态检测抗体产生水平。结果PCR法克隆出全长为903bp的fimH和720bp的fimC基因,构建的原核表达质粒pGEX-4T-2-fimH及pGEX-4T-2-fimC经诱导可分别表达出60KD和48KD左右的GST融合蛋白;蛋白经纯化后免疫动物能诱导产生高效价的IgG抗体。结论成功获取了UP-ECⅠ型菌毛基因fimH和fimC,所构建的原核表达质粒在BL-21中成功表达;fimH有免疫原性。

尿路致病性大肠杆菌外膜蛋白T的致病机制

目的探讨大肠杆菌外膜蛋白T(OmpT)参与尿路致病性大肠杆菌致病的机制。方法通过建立人膀胱癌移行上皮细胞模型,检测野生株CFT073、ompT基因敲除株COTD、回补株COTD(pST)的体外黏附情况;比较野生株、敲除株和回补株对细胞外基质的体外黏附能力;通过荧光定量PCR方法,比较ompT基因敲除以后,iha和iroN基因的mRNA表达水平;建立小鼠动物模型,比较有无OmpT菌株所致小鼠膀胱和肾脏的细菌载量、血液菌浓度及炎症因子IL-6和IL-8的蛋白表达水平,验证OmpT的致炎作用。结果野生株细胞黏附率为(8.81±1.13)%,敲除株为(4.62±0.39)%,敲除株的黏附率明显低于野生株(P<0.05);野生株的细胞外基质黏附率为(8.85±0.79)%,敲除株为(4.95±0.59)%,敲除株的黏附率明显低于野生株(P<0.05);与敲除株比较,iha和iroN基因在野生株中的表达水平分别是敲除株的2.1和3.8倍;野生株感染的小鼠膀胱组织中细菌载量均数为6.36±0.06,敲除株为6.01±0.07,回补株为6.29±0.06,野生株感染的小鼠肾脏组织中细菌载量为6.25±0.05,敲除株为5.87±0.06,差异均有统计学意义(P<0.05);野生株和回补株所致小鼠膀胱和肾脏组织炎症中IL-6检出的阳性率分别为60%和50%,而ompT基因敲除株则为12.5%。IL-8的表达情况同IL-6。结论初步证实OmpT通过发挥毒力因子的作用,从而影响尿路致病性大肠杆菌对宿主细胞的黏附,其可能机制是影响细菌对细胞外基质的黏附和参与iha和iroN基因的表达并在致炎过程中发挥重要作用。

原花青素对尿路致病性大肠杆菌黏附、侵袭膀胱上皮细胞的影响及其机制

目的探讨原花青素对尿路致病性大肠杆菌(UPEC)黏附、侵袭膀胱上皮细胞的影响,并探讨其作用机制。方法体外培养人膀胱上皮细胞T24,随机分为空白对照组、阴性对照组和原花青素组,阴性对照组和原花青素组分别加入等量DMSO和亚抑菌浓度的原花青素溶液。采用平板菌落计数法检测各组UPEC J96对膀胱上皮细胞T24的相对黏附率和相对侵袭率;采用RT-PCR法检测各组细胞表面整合素受体α3和β1 mRNA表达;采用流式细胞术检测各组纤维状肌动蛋白(F-Actin)相对荧光强度。结果与空白对照组和阴性对照组比较,原花青素组UPEC J96的相对黏附率和相对侵袭率均明显降低(P均<0. 01),T24细胞表面整合素受体α3、β1 mRNA相对表达量均明显下降(P均<0. 01)。与空白对照组和阴性对照组比较,原花青素组无论是UPEC J96未感染细胞还是UPEC J96感染细胞,F-Actin相对荧光强度均明显降低(P均<0. 01)。空白对照组与阴性对照组上述指标比较P均> 0. 05。结论原花青素可抑制UPEC黏附、侵袭膀胱上皮细胞,其机制可能通过抑制膀胱上皮细胞表面整合素受体及F-Actin表达实现。

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fim H基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建以尿路致病性大肠杆菌临床分离株Ⅰ型菌毛编码基因fimH为目的基因的真核表达载体pcDNA3.0-fimH。方法提取尿路致病性大肠杆菌临床株基因组DNA,PCR扩增fimH基因片段,然后克隆至TA载体,通过PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段用限制性内切酶切下克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒。通过PCR、酶切对重组质粒pcDNA3.0-fimH进行鉴定。结果 PCR法克隆出全长为903 bp的fimH基因并构建了pcDNA3.0-fimH重组质粒。结论本研究成功构建尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒pcDNA3.0-fimH,为尿路致病性大肠杆菌基因疫苗的研制奠定了基础。

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛的FimH蛋白与DNA免疫效果比较

目的:用尿路致病性大肠杆菌(UPEC)Ⅰ型菌毛FimH蛋白的DNA和蛋白免疫小鼠,以观察不同组别的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫的效果。方法:将fimH质粒、fimC质粒,FimH、FimC蛋白经多种组合免疫小鼠,ELISA法检测外周血中抗FimH蛋白的特异性IgG和膀胱中的SIgA,流式细胞仪检测脾脏中CD3、CD4、CD8三种T细胞亚群的变化。结果:DNA免疫后血清中可检测出特异性IgG,但效价较低,可检测出较低效价的SIgA,脾脏中CD4+T细胞百分含量较高,引起较强的细胞免疫。蛋白免疫后血清特异性IgG较高,发生较强的体液免疫,未测出SIgA。结论:FimH蛋白的DNA疫苗引起细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫,蛋白疫苗只能诱导体液免疫,FimC蛋白能增强FimH蛋白的免疫原性。

尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建以尿路致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛 fimH基因为靶位的真核表达质粒 ,并使其在小鼠肌肉中表达。 方法 应用PCR方法及基因重组技术 ,克隆了尿路致病性大肠杆菌标准菌株J96 fimH基因 ,并将fimH基因插入真核表达载体pcDNA3中。免疫BALB/c小鼠 ,用免疫组化染色法观察表达情况。结果与结论 成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-fimH ,序列分析显示 ,fimH基因核苷酸序列与GenBank上登录的一致 ,fimH蛋白在小鼠肌肉组织细胞内呈分散表达。

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的克隆和序列分析

目的构建尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)溶血素A(hemolysin A,HLYA)hlya基因重组质粒。方法根据已知GenBank中的hlya基因序列,设计合成一对引物,用PCR方法从尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因组DNA中扩增编码hlya的基因片段,克隆至pUC18质粒,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经酶切及PCR鉴定,而后进行测序。结果hlya基因体外扩增产物大小约744bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,测序结果与已知序列基本吻合。结论在国内首次克隆了尿路致病性大肠杆菌hlya基因,为研究hlya的功能和探讨hlya作为特异性诊断靶抗原的研究奠定了基础。

尿路致病性大肠杆菌中钼辅因子调控溶血素表达并参与细菌毒力的分子机制

尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是肠(道)外致病性大肠杆菌的一种。UPEC感染人后可致膀胱炎、肾盂肾炎或败血症;UPEC还可感染动物致禽或猪的脑部及系统感染、犬猫等的尿路感染。UPEC菌株具有多样性,编码多种毒力因子,如菌毛、铁载体、毒素等。其中,溶血素(Hemolysin)能诱导细胞死亡,与临床症状的严重性高度相关。

一株尿路致病性大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

本研究从尿路感染患者尿液样本中分离、鉴定大肠杆菌裂解性噬菌体,对其裂菌活性等生物学特性进行分析,为探索应用噬菌体治疗耐药性尿路致病性大肠杆菌导致的尿路感染奠定基础。利用双层琼脂平板法,从尿液样品中分离、纯化,得到一株能裂解大肠杆菌的噬菌体。通过电镜观察噬菌体形态,测定其裂菌谱、最佳感染复数、一步生长曲线、以及热稳定性、紫外敏感性和氯仿敏感性等生物学特性。结果显示,成功分离、纯化得到一株能高效裂解大肠杆菌的噬菌体vB_EcoS_JA2,该噬菌体可形成圆形、透明、边缘整齐的噬菌斑;电镜观察噬菌体的头部呈六边形,含可收缩性尾部,尾部较长;一步生长曲线显示,该噬菌体的潜伏期为10 min、爆发期为60 min、裂解量高达124 PFU/Cell,其最佳感染复数为0.1;JA2具有较好的热稳定性,且对紫外线具有一定的抵抗力。分离鉴定的噬菌体JA2能裂解致病性大肠杆菌,具有稳定性好,抵抗力强的特点,为应用噬菌体治疗致病性大肠杆菌导致的尿路感染提供了新材料。

尿路感染患者常见病原菌分布及耐药性分析

目的分析徐州医科大学附属医院尿路感染患者尿液标本的病原菌分布及大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药情况,为合理选用抗菌药物提供指导依据。方法收集2021年8月—2022年7月徐州医科大学附属医院送检的3882份自行收集或无菌导出的尿液标本,并进行中段尿培养,分析尿培养阳性标本病原菌分布结果、大肠埃希菌检出科室分布情况及其抗菌药物敏感性。结果3882份送检尿培养标本中尿培养阳性标本共881份(22.69%),其中由单一菌株引起的有846份,由2种混合菌株引起的有35份;共分离出916株病原菌,其中检出512株革兰阴性菌(55.90%),以大肠埃希菌(306株,33.41%)和肺炎克雷伯菌(75株,8.19%)为主;检出革兰阳性菌188株(20.52%),以屎肠球菌(80株,8.73%)和粪肠球菌(27株,2.95%)为主;检出216株真菌(23.58%),以白假丝酵母菌(77株,8.41%)和热带假丝酵母菌(58株,6.33%)为主。尿路致病性大肠埃希菌(UPEC)分离株中8.50%(26/306)分离自门诊患者,91.50%(280/306)分离自住院患者,其中泌尿外科、肾脏内科、风湿免疫科、神经内科和重症监护室(ICU)的检出率依次为32.68%、20.92%、8.50%、6.86%、6.21%。UPEC对替卡西林(88.24%)、头孢呋辛(61.49%)、头孢呋辛酯(62.94%)、左氧氟沙星(72.46%)和复方新诺明(58.03%)的耐药性较高,耐药率均高于50%;对其他抗菌药物较为敏感。结论该院尿路感染标本中病原菌构成复杂、种类多样,其中革兰阴性菌是尿路感染的主要致病菌,以大肠埃希菌占比最多,部分病原菌呈现高水平耐药。患者应积极配合医生开展病原菌鉴定及药物敏感试验,以便合理选用抗菌药物,避免多重耐药菌和新型耐药菌的出现。

尿路致病性大肠杆菌溶血素A基因的序列分析

目的分离尿路致病性大肠杆菌(UPEC)临床流行株,并进行序列分析。了解其基因变异情况。方法自临床尿路感染标本中分离溶血性大肠杆菌10株。按GenBank中的溶血素A(hlya)基因保守序列设计合成引物。以获得的UPEC基因组DNA为模板,用PCR方法扩增其hlya基因片段。对扩增的片段测序并进行同源性分析。结果扩增的hlya目的基因大小744bp。经PCR鉴定表明获得正确的片段。测序结果显示,10个分离株DNA序列同源性高于99.7%,其与GenBank中的hlya基因序列的同源性为99%以上。10个序列中共发生13处碱基的替代,但均属于同义突变,没有碱基的插入与缺失。结论UPEChlya基因高度保守。本研究在国内首次成功地扩增了UP-EC基因。为进一步研究hlya的结构、阐明UPEC的致病机制、探讨hlya作为特异性诊断靶点及保护性疫苗的研究奠定了基础。

尿路致病性大肠杆菌中Ⅰ型限制-修饰系统C5423-5425的鉴定

【目的】多方面鉴定尿路致病性大肠杆菌中的Ⅰ型限制-修饰(restriction-modification,RM)系统C5423-5425,并揭示其功能与生理意义。【方法】利用Lambda Red重组系统构建CFT073 DNA甲基化转移酶基因缺失株Δc5424;利用单分子实时测序分析以获得C5424甲基化修饰的位点与基序;利用转化效率试验说明RM系统抵御外源DNA的转化;利用转录组测序和荧光定量RT-PCR鉴定C5424的调控基因;利用软琼脂平板运动试验等方法研究细菌生理功能的变化。【结果】用生物信息学方法鉴定了一个Ⅰ型RM系统;获得了c5424的突变株;鉴定了C5424修饰的靶序列G^(m)AGNNNNNNNGTCA/TG^(m)AC NNNNNNNCTC,并揭示了靶序列在基因组中的分布;C5424系统可以抵御外源DNA的进入;c5424的缺失显著影响17个基因的表达,包括运动相关基因motB和抗活性氯基因rclR等;c5424的缺失显著影响CFT073的运动能力和抗次氯酸的能力。【结论】本文从多方面鉴定了尿路致病性大肠杆菌CFT073中的I型RM系统C5423-5425,这个系统对细菌具有重要的生理意义。本文对研究细菌的表观遗传学具有参考价值。

扶正清热利湿法防治再发性尿路感染随机对照研究

目的评价扶正清热利湿法辨证防治再发性尿路感染的临床疗效。方法采用平行、随机、对照的前瞻性临床研究方法,根据中医辨证标准将确诊为再发性尿路感染患者分为阴虚湿热证和阳虚夹湿证2层,每层采用区组随机法分为治疗组和西药组,共纳入观察病例74例。其中阴虚湿热证中药组37例,西药组17例;阳虚夹湿证中药组13例,西药组7例。阴虚湿热中药组采用滋阴降火、清热通淋法治疗,口服通淋1号方;阳虚夹湿中药组采用补脾固肾、温阳通淋法,口服通淋2号方。4组疗程均为4周。两证型西药组均根据药敏结果选用抗生素同时服用安慰剂,疗程1周。共随访6个月。观察扶正清热利湿法辨证治疗对于再发性尿路感染细菌清除率、复发率的影响。结果治疗第14天,中药组细菌清除情况优于西药组,而随监测时间延长,2组差异越来越小;在疗程结束时,2组细菌清除率相当。对于产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希氏菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌,中药均可有效清除,西药组则未能清除。6个月后随访,中药组复发率均低于西药组,阴虚湿热证组与阳虚夹湿证组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论中医辨证防治再发性尿路感染疗效优于西药。

耐药性尿路感染病原菌抗菌治疗策略研究进展

尿路感染是社区和医院最常见的疾病之一,其高发病率及高复发率导致患者的住院费用、治疗费用等医疗成本极高。尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是引起尿路感染的主要病原体,UPEC在尿路上皮细胞的黏附能力是其致病力的决定性因素。此外,UPEC表面大量的菌毛、鞭毛等结构及其分泌的毒力因子也进一步增强了其致病力。本文将重点聚焦UPEC的毒力特征和耐药性,同时关注疫苗、天然抗菌化合物以及抗黏附创新药物等预防尿路感染的方法,以期为耐药性尿路感染的防治提供参考。

舰员尿道致病性大肠杆菌毒力因子检测的临床意义

来源于有症状的尿路感染的大肠杆菌（Esheriehia coli）通常具有与健康人肠道中的大肠杆菌不同的性质。其中P菌毛和溶血素在尿路感染的发病机理方面的作用，近年来得到越来越多的关注，进行性肾盂肾炎的小鼠模型证明了P菌毛大肠杆菌在肾脏组织的数量远比无菌毛或1型菌毛大肠杆菌多，在体外，P菌毛粘附于人类肾脏组织并有抗吞噬作用。尽管在一些动物模型中已证明溶血素可以增进大肠杆菌的毒力，但溶血素在尿路感染中的主要作用还不是很清楚。有关尿源大肠杆菌的毒力因子的研究，国外已有很多报道，包括致尿路感染的大肠杆菌的P菌毛和溶血素的同源多拷贝DNA序列探针以及限制性片段长度多态性等研究。但作为临床检验这些方法比较繁琐。本文旨在通过PAP、PILC和HIYA基因编码的P菌毛、1型菌毛粘附以及产生溶血素的表达，根据相关的P菌毛具有对甘露糖抗性的血凝性质，1型菌毛具有对甘露糖敏感的血凝性质以及溶血素引起绵羊红细胞破坏三种表型特征，进行了尿路致病性大肠杆菌毒力因子的临床检测，报告如下。

急性尿路感染大鼠模型的建立及在中药药效评价中的应用

目的:建立急性尿路感染大鼠模型,并探讨其在药效评价中的应用。方法:SD大鼠采用经尿道膀胱灌注尿路致病性大肠埃希菌CFT073的方法建立尿路感染模型:大鼠感染后以尿液中白细胞及潜血为指标优化感染条件;使用优化后的条件造模并给予三金片治疗,检测模型组白细胞及潜血分级,尿液及肾脏中的细菌数,并称取膀胱组织重量,检测膀胱组织病理变化并观察三金片对模型组的治疗作用。结果:以大鼠尿液中白细胞及潜血的阳性率为指标优化感染条件为CFT073细菌1×10^7 CFU/只的浓度感染3天;以优化后的条件造模,模型组尿液中白细胞及潜血水平明显升高,尿液及肾脏中有大量细菌,膀胱指数增加,炎性损伤明显;三金片250 mg/kg给药三天后可明显降低尿路感染大鼠尿液中的白细胞水平,降低尿液及肾脏细菌,减轻膀胱组织损伤。结论:本实验成功建立与临床症状相似的尿路感染大鼠模型,可用于评价药物对急性尿路感染的治疗作用。