以L929细胞为滋养层的尿道黏膜上皮细胞体外培养

目的 探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法 ,为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础 ,并为尿道黏膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。 方法 取刚离乳的雄性新西兰幼兔尿道黏膜组织 ,分别以 Dispase 消化液和混合消化液消化成单细胞悬液 ,以差速贴壁法排除成纤维细胞 ,接种后以 L92 9细胞为滋养层细胞进行培养 ,定期换液 ,细胞生长、增殖至 80 %～ 90 %融合时传代。细胞进行常规 HE染色、流式细胞仪检测 ,以扫描电镜、透射电镜观察其超微结构。再分别设立实验组 (n=2 0 )、阳性对照组 (正常尿道黏膜组织石蜡切片 ,n=2 0 )及阴性对照组 (成纤维细胞铺片 ,n=2 0 )行免疫组织化学染色。 结果 原代培养 10天左右细胞逐渐生长融合成片 ,如铺路石状 ,细胞大小均一。上皮细胞为二倍体细胞 ,生长期内均为单一的上皮细胞 ,无成纤维细胞混杂生长 ,细胞可传 11～ 13代 ,成活 5 0～ 6 0天。 结论 新西兰幼兔尿道黏膜上皮细胞可在体外进行培养 ,在一定时间内保持增殖活力 ,为构建组织工程化尿道奠定了基础 ,且为尿道黏膜的体外研究提供了实验模型。

原位定量检测体外培养的尿道黏膜上皮细胞活性

目的解决在不透明载体上观察细胞生长状况的难题。方法取雄性新西兰幼兔1只,进行尿道黏膜上皮细胞的原代培养并传至第3代。将其接种于胶原-壳聚糖复合材料上,体外培养3、7、14和21d后,行6-羧基二乙酸甲酯荧光素与碘化丙啶荧光双染,并应用激光共聚焦细胞仪检测。结果尿道黏膜上皮细胞在胶原-壳聚糖复合材料载体上生长,增殖良好。培养3、7d,活细胞荧光强度值为(1.09±0.13)×108、(2.04±0.13)×108,培养14、21d活细胞荧光强度值分别为(0.55±0.09)×108、(0.47±0.03)×108,与培养3、7d比较差异均有统计学意义(P<0.05)。各时间点死细胞荧光强度值差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用激光共聚焦细胞仪对不同波长荧光强度分别进行定量分析,可以在原位定量快速检测尿道黏膜上皮细胞活性,动态观察组织工程组织生长情况,解决无法在不透明载体上观察细胞生长状况的难题。

以兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞为种子细胞构建组织工程尿道的比较

目的比较兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞的表型及生物学特性,探索毛囊干细胞作为组织工程尿道种子细胞的可行性。方法体外分离、培养兔毛囊干细胞和尿道黏膜干细胞,并使用流式细胞仪分选富集直径<10μm、integrin-α6+/CD71-的干细胞。计算两种干细胞的最大扩增倍数和克隆形成能力,使用流式细胞仪检测两种干细胞K19、p63、β1-in-tegrin的阳性表达率。将富集毛囊干细胞和尿道黏膜干细胞接种在尿道支架上,构建组织工程尿道,应用组织学、荧光染色法观察体外构建的组织工程尿道的情况。结果兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞的最大扩增倍数分别为(6.1±0.8)×104倍、(7.1±1.1)×103倍,克隆形成率分别为(10.1±1.3)%、(4.3±1.1)%。K19、p63、β1-integrin在毛囊干细胞中阳性表达率分别为(90.53±6.77)%、(93.31±5.57)%、(91.17±6.98)%,在尿道黏膜干细胞中阳性表达率分别为(88.50±4.95)%、(91.63±5.86)%、(93.35±6.28)%。毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞在支架上都能形成复层上皮样结构,AE1/AE3染色阳性。结论兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞都可以作为种子细胞构建组织工程尿道;在种子细胞获取方面,毛囊干细胞优于尿道黏膜干细胞。

人包皮组织脱细胞基质的制备与生物相容性

目的制备人包皮组织脱细胞基质移植物(AMGs),探讨其浸提液对兔尿道黏膜细胞毒性。方法制备人包皮组织脱细胞基质后,通过Masson染色观察脱细胞后基质的表征,扫描电子显微镜观察其孔径大小。体外培养尿道黏膜细胞,采用免疫荧光鉴定其AE3表达。尿道黏膜细胞与AMGs基质浸提液体外共培养,MTT法检测AMGs浸提液对尿道黏膜细胞毒性。结果Masson染色显示细胞去除干净,只有胶原蛋白构成的支架,扫描电镜显示支架的孔径为20~50μm,分布均匀,形态良好。适当浓度的AMGs基质浸提液对尿道黏膜细胞无明显毒性。结论人包皮组织脱细胞基质为理想的AMGs支架材料,制备的AMGs材料细胞毒性小,有一定的实用价值。

人尿道黏膜上皮细胞系与脱细胞羊膜基质复合培养的实验研究

目的探讨人尿道黏膜上皮细胞系与脱细胞羊膜基质复合培养的效果。方法将人尿道黏膜上皮细胞系接种于脱细胞羊膜基质上,待细胞在脱细胞羊膜基质上生长至铺满表面,用活细胞示踪剂标记细胞,然后将脱细胞羊膜基质固定、封片,倒置相差和荧光显微镜下进行观察。结果人尿道黏膜上皮细胞系细胞在脱细胞羊膜基质上生长,细胞呈单层生长,活细胞示踪剂显示细胞生长良好,并具有活细胞功能。结论人尿道黏膜上皮细胞系是良好的实验室组织工程化尿道种子细胞,脱细胞羊膜基质是良好的实验室组织工程化尿道支架材料,适用于实验室组织工程化尿道复合过程研究。