鸭源产尿酸氧化酶菌株的筛选及其降尿酸能力评估

试验旨在从鸭粪便中筛选具有高产尿酸氧化酶的菌株,为缓解和治疗家禽高尿酸血症提供新的解决方案。试验从健康肉鸭新鲜粪便中筛选能在尿酸筛选培养基上产生透明圈的菌株,采用平板点种法测定菌株的产酶活性,采用16S rDNA测序法进行分子鉴定。试验菌株拌料饲喂樱桃谷鸭评定饲用效果,并评估候选菌株对高尿酸樱桃谷鸭的影响。结果显示,初步筛选出56株产尿酸氧化酶的菌株,其中1株有产蛋白酶能力、7株有产淀粉酶能力;91%的菌株为革兰氏阴性菌,对27株进行分子鉴定,15株为产碱杆菌属。菌株AS1、P56分别与粪产碱杆菌、瓜里科假单胞菌同源性最高。菌株AS1、P56对鸭平均日采食量、体重无明显影响,AS1可显著降低高尿酸血症鸭的血清尿酸水平(P<0.05)。研究表明,利用尿酸筛选培养基可从鸭粪便中筛选出高产尿酸氧化酶的菌株,AS1可作为候选菌株为后续缓解和治疗家禽高尿酸血症提供参考。

尿酸氧化酶基因的克隆、表达及其产物的应用

克隆了产朊假丝酵母 (Candidautilis)AS2 117尿酸氧化酶 (UrateOxidase,Uricase,EC1.7.3 .3)的基因。将此基因插入原核表达质粒pET2 1a后转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,获得高表达的重组转化子菌株。经IPTG诱导 ,重组尿酸酶基因表达量可达菌体可溶性蛋白的 40 %。重组尿酸氧化酶为有酶活性的可溶蛋白。Western印迹分析证实表达产物有免疫学活性。经DEAEDE5 2纤维素离子交换柱层析纯化 ,目的蛋白纯度可达 95 %。重组蛋白和天然蛋白的理化特征比较证明重组蛋白的热稳定性有较大提高。酶盒配制和临床应用实验表明重组蛋白可代替天然蛋白进行临床血清尿酸的分析。

海洋高产尿酸氧化酶菌株筛选鉴定及酶学性质研究

尿酸氧化酶广泛用于常规临床分析和临床药物,在医学治疗和诊断中的重要性日益增加。为得到高产尿酸氧化酶的优良菌株,以大连黄海海泥、海水为材料,依次分别采用透明圈法、酶偶联分光光度法进行初筛和复筛,获一株高产尿酸氧化酶菌株Z7,根据菌株Z7的16S rDNA基因序列和形态学、生理生化特征,该菌株被鉴定为苛求芽孢杆菌(Bacillus fastidiosus)。酶学性质研究表明:尿酸氧化酶蛋白的分子量约为33.1 kD;最适作用温度是25℃,酶活高达673.7 U/mg;最适作用pH为8.0,在pH 8-9表现出较强的稳定性;Fe^3+、Ca^2+对尿酸氧化酶具有激活作用。Ag^+、Hg^2+对该酶抑制性较强,使其几乎丧失活性。该菌株产酶活性及稳定性良好,可为尿酸氧化酶的工业化生产奠定理论基础,并具有潜在开发价值。

微生物来源的尿酸氧化酶的研究进展及应用前景

尿酸氧化酶是一种重要的医药用酶,它催化嘌呤代谢途径中的尿酸氧化生成尿囊素和过氧化氢,因而被广泛用于治疗痛风,检测血液尿酸浓度,预防和治疗由于肿瘤化学治疗引起的高尿酸血症。综述了尿酸氧化酶的来源、酶学性质、基因克隆与表达及其用途,并对其在应用中存在的问题和前景作了展望。

以γ-氧化铝固定尿酸氧化酶的尿酸传感器研究

介绍了一种新型的酶生物传感器，以具有一定规整结构的γ－氧化铝（γ－Ａｌ２Ｏ３）固定 尿酸氧化酶制备了尿酸传感器，利用傅里叶变换红外光谱研究了γ－Ａｌ２Ｏ３与尿酸氧化酶之 间的相互作用；为了探讨吸附与γ－Ａｌ２Ｏ３间的相互作用，分别用Ｎ２的吸附－脱附等温线和质 量滴定法测定了γ－Ａｌ２Ｏ３的孔分布和等电点，解释了 ｐＨ对吸附的影响，并对电极的制备条 件和工作性能进行了考察，结果表明电极对尿酸在１．０×１０－５～７．５×１０－４ｍｏｌ／Ｌ范围内有着 灵敏快速的响应，检出下限为２．０×１０－６ｍｏｌ／Ｌ。该实验对固定化酶反应机理的研究和应用 提供了理论基础。

产尿酸氧化酶基因工程菌的构建

目的将尿酸氧化酶基因克隆到保加利亚乳酸杆菌中,使之能产生尿酸氧化酶,为开发能够分解尿酸、对高尿酸血症有治疗作用的可食用基因工程菌奠定基础。方法根据genbank上已知的产朊假丝酵母菌尿酸氧化酶基因序列(Uricase,E12709),PCR扩增尿酸氧化酶基因片段,将其插入质粒pMG36e,构建成重组质粒pMG36e-U,电转化保加利亚乳酸杆菌,SDS-PAGE鉴定基因工程菌体裂解液中的尿酸氧化酶,测定尿酸氧化酶活性。结果从产朊假丝酵母基因组中PCR扩增到尿酸氧化酶基因,并构建成含有尿酸氧化酶基因的重组质粒pMG36e-U,重组质粒pMG36e-U电转化保加利亚乳酸杆菌成功构建了含尿酸氧化酶的基因工程乳酸杆菌。SDS-PAGE测定基因工程菌合成的尿酸氧化酶亚基分子量约为34 kD,在体外测定菌酶液活性可达0.33 U.mL-1。结论尿酸氧化酶基因克隆入保加利亚乳酸杆菌中,并具有酶分解能力。

人体肠道中产尿酸氧化酶细菌的筛选、鉴定与酶学性质研究

该文从人体肠道中筛选出1株产尿酸氧化酶菌株,经形态观察及分子生物学(16S rDNA测序)鉴定为彭氏变形杆菌,命名为Proteus penneri JC-5。随后对其所产尿酸酶进行酶学性质研究,实验结果表明,该酶最适作用温度为35℃,热稳定性较差;最适pH 8.0,在弱碱条件下有较好稳定性;Ca^2+与Mn^2+对该酶有激活作用,Ca^2+激活作用较强,Fe^2+、K+、Mg^2+、Cu^2+、Zn^2+对该酶活性有抑制作用。

一种来源于克劳氏芽孢杆菌的高碱性尿酸氧化酶的异源表达及重组酶性质分析

以碱性蛋白酶生产菌克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)基因组DNA为模板PCR扩增获得尿酸氧化酶基因(BcU),插入原核表达载体pET28α中,构建表达载体pET-BcU,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-BcU。经IPTG诱导,重组菌BL21(DE3)/pET-BcU表达出有活性的尿酸氧化酶,含空质粒的重组菌在同样条件下没有酶活。酶学性质分析显示,重组酶最适pH值为9.0,在pH值9.0～11范围内酶活几乎不变,是一种高碱性尿酸氧化酶。

尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的构建含尿酸氧化酶与肌酐水解酶融合基因的质粒并转化大肠杆菌,使其能同时分泌该两种酶分解尿酸及肌酐。方法根据GenBank数据库已知的尿酸氧化酶基因设计引物,扩增到去掉终止密码子的尿酸氧化酶基因中,并使其连接到质粒pGM36e上构建成pGM36e-U,然后根据已知肌酐水解酶基因设计引物扩增肌酐水解酶基因,把其连接到质粒pGM36e-U中尿酸氧化酶基因后构建成重组质粒pGM36e-U/C,转化大肠杆菌,筛选鉴定重组大肠杆菌,并进行SDS-PAGE分析。将工程菌于特定浓度肌酐和尿酸的培养基中培养24 h,取培养液测定肌酐和尿酸浓度。结果重组质粒得到大小约1.68 kb基因片段。为尿酸氧化酶及肌酐水解酶之合。转化大肠杆菌后尿酸氧化酶及肌酐水解酶活性得到表达。肌酐分解率提高43.50%,尿酸分解率提高42.32%。结论构建的含复合基因的重组质粒转化大肠杆菌后能表达尿酸氧化酶及肌酐水解酶活性。分解尿酸和肌酐。

家蚕尿酸氧化酶基因BmUo的克隆及其序列分析与原核表达

尿酸氧化酶(urate oxidase;EC1.7.3.3)能够降解尿酸形成尿囊素,在嘌呤代谢途径中起到至关重要的作用。用生物信息学方法在家蚕基因组数据库中进行同源性检索,获得一条可能的家蚕尿酸氧化酶序列,根据预测序列设计引物及克隆、测序验证,已成功地克隆到家蚕尿酸氧化酶基因BmUo的完整ORF。克隆的cDNA(GenBank登录号:DQ189992)全长1088bp,ORF长1014bp,编码337个氨基酸残基,预测分子质量为38.18kD,等电点为6.90。通过半定量RT-PCR检测了该基因在各组织的表达情况,发现该基因的mRNA在5龄第3天的家蚕的脂肪体和马氏管中有表达。该基因在氨基酸水平上与果蝇、按蚊尿酸氧化酶的相似性分别为45.6%和51%,在第91个氨基酸残基处具有Asn-Ser-X-Val/Ile-Val/Ile-Ala/Pro-Thr-Asp-Ser/Thr-X-Lys-Asn的高度保守序列,这一序列在真核生物和原核生物中均广泛存在,可能与尿酸氧化酶的酶活性有关。家蚕尿酸氧化酶与其他38个物种尿酸氧化酶的聚类分析发现,尿酸氧化酶基因在昆虫、真菌、双子叶植物和哺乳动物这一层面上是相对保守的。将BmUo基因片段与pET-28a连接,构建原核表达载体pET-28a/uo,重组载体转化大肠杆菌BL21后,在37℃的培养条件下可检测到与理论分子质量相符的蛋白条带。

尿酸氧化酶的研究及其应用

随着对血液中尿酸含量影响的研究发现,控制尿酸含量对于治疗一些疾病有着重要的作用,而尿酸氧化酶作为有效的控制尿酸含量的治疗试剂越来越受到关注。本文综述了尿酸氧化酶的来源、结构、酶学性质以及当前尿酸氧化酶在临床上应用的研究,并对尿酸氧化酶研究和应用中存在的问题和今后研究的发展做了展望。

猪尿酸氧化酶基因的克隆及表达

本研究主要涉及猪尿酸氧化酶(urate oxidase,EC 1.7.3.3)的原核表达载体的构建及蛋白表达,并对其酶活性进行测定。从猪肝组织细胞中提取总的RNA,利用RT-PCR技术克隆pUOX(porcine urate oxidase),插入原核表达载体pET-22b中,构建重组表达载体pET-22b/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。通过IPTG诱导获得的重组蛋白经SDS-PAGE检测,在约34 ku处有一清晰蛋白条带,这与预期分子量一致。测定该重组蛋白的酶活力达到1.962 U,这为后期实验奠定了重要的基础。

斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达

目的探讨斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达的方法,研究重组斑马鱼尿酸氧化酶(ZUO)的理化性质与生物学功能。方法用PCR的方法克隆斑马鱼尿酸氧化酶基因,用pET28a质粒进行原核表达。结果成功克隆了斑马鱼尿酸氧化酶基因并完成了测序鉴定,该基因在大肠杆菌表达系统中得到有效表达且具有体外氧化尿酸的生物学功能。目的蛋白为胞内可溶性蛋白,占可溶蛋白总量的50%左右。最佳诱导条件为27℃16 h,粗酶最佳溶解pH为9.16,在此缓冲液溶解条件下,粗酶比活性为1.94 U/mg。获得的重组ZUO产量达64.8 U/g湿菌,高于直接从动物肝脏组织萃取的尿酸氧化酶。结论斑马鱼尿酸酶基因能在大肠杆菌表达系统中表达,其溶解pH比基因工程表达的重组猪尿酸氧化酶略低,对后续开发痛风治疗新药有利。

小剂量尿酸氧化酶治疗急性脑梗死的临床效果

①目的 探讨小剂量尿酸氧化酶治疗急性脑梗死的效果。②方法 将 10 6例急性脑梗死病人随机分为治疗组 5 6例 ,对照组 5 0例。对照组应用脱水剂、活血化淤、脑保护剂及抗凝剂等治疗。治疗组在对照组的基础上加用小剂量尿酸氧化酶治疗。③结果 在治疗后 2 4h ,治疗组与对照组的临床评分差异无显著性 (F =2 .17,P >0 .0 5 )。治疗后 7d ,30d临床评分 ,两组差异有显著性 (F =4 .6 6 ,q =12 .11,9.87,P <0 .0 5 ;F =6 .2 3,q =17.83,11.91,P <0 .0 5 ) ;6h以内与 7～ 2 4h溶栓治疗在 7d ,30d的临床评分也有显著性差异 (q=7.2 9,8.16 ,P <0 .0 5 )。④结论 小剂量尿酸氧化酶治疗急性脑梗死在临床上有一定的疗效 ,并且安全、方便。溶栓时间越早效果越好。

一株洱海来源产尿酸氧化酶菌株的分离、鉴定及其酶学性质研究

尿酸氧化酶作为生物体内嘌呤降解代谢途径的关键酶,能催化尿酸氧化为尿囊素。由于人类尿酸氧化酶基因的失活,高浓度的尿酸会引发痛风、高尿酸血症等多种尿酸代谢疾病。因此,挖掘新的尿酸氧化酶来源,对于尿酸代谢疾病的治疗十分必要。本研究以大理洱海底泥为材料,经富集培养和纯培养分离,获得1株产尿酸氧化酶细菌,基于16S rRNA基因序列分析鉴定为克雷伯氏菌属菌株(Klebsiella sp.DLEH-68)。通过发酵获得粗酶液,对该菌株的尿酸氧化酶的酶学性质进行研究。结果表明:该菌株产生尿酸氧化酶为胞内酶,在最适反应温度35℃,最适反应pH 7条件下,其酶活力为0.015 U/mL;在35℃下孵育100 min或pH 4~8孵育12 h,其仍保持60%以上的相对活性。本研究为大理洱海产尿酸氧化酶菌株的研究和潜在运用奠定了基础。

重组猪尿酸氧化酶在血浆尿酸浓度测定中的应用

目的:探讨纯化重组猪尿酸氧化酶在人血浆尿酸检测中应用的可行性。方法:尿酸测定方法为酶比色法。每个测定样品做3个平行管,取平均值计算测定结果。比较自制血尿酸检测试剂与商品试剂的准确性、回收率、批间差、批内差和线性误差等主要性能指标。用自制试剂测定医院血浆样品,将测定结果与医院测定结果进行比较。结果:自制试剂与商品试剂的主要性能指标接近,自制试剂测定的血浆尿酸值与商品试剂测定值高度相关(R2=0.9741)。结论:重组猪尿酸氧化酶可用于酶比色法检测血浆尿酸含量。

抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体。方法:采用杂交瘤技术,获得2株针对重组黄曲霉尿酸氧化酶(rUOX)的杂交瘤细胞McAb17和McAb3;采用盐析和A蛋白亲合层析柱纯化该抗体。结果:McAb17和McAb3的腹水效价达到1∶512000,纯化后获得纯度大于95%的单抗,抗体亚类(型)分别为IgG1/k型和IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的单抗与rUOX和Rasburicase(商品化rUOX)可发生特异反应。结论:制备了抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体McAb17和McAb3,为检测rUOX在动物体内的代谢变化提供了良好的实验基础。

重组尿酸氧化酶发酵工艺优化

目的:优化并获得重组尿酸氧化酶(rUOX)基因工程大肠杆菌BL21(DE3)/pET-32a-uox高密度发酵的工艺参数。方法:在三角摇瓶中进行培养条件的优化实验,分别考察了pH值、接种量、无机盐、碳源、诱导强度等对工程菌生长和重组蛋白表达的影响,得到了优化的发酵条件;在此基础上放大至NBS BIOFLO 110 14 L发酵罐,通过对诱导时机的优化,利用分批补料发酵的方式,使rUOX在高密度培养的条件下得到高表达。结果:在优化的发酵条件下,菌体密度(D600nm)最终达到50以上,相当于20 g/L干重;可溶性rUOX占菌体总蛋白量的45%,其含量达到3.45 g/L。结论:为规模化制备重组黄曲霉尿酸氧化酶奠定了基础。

PEG化重组尿酸氧化酶蛋白含量测定方法研究

目的：以未修饰的原型蛋白为对照品，建立准确测定2种聚乙二醇化重组尿酸氧化酶（PEG-rUOX）含量的方法。方法：以原型蛋白rUOX为对照品，利用凝胶色谱法测定PEG-rUOX中的蛋白含量，通过详细的专属性、精密度、准确性等方法学考察，建立该方法。色谱条件：采用TSK Gel 5000PWxl（300 mm×7.8 mm）凝胶色谱柱，以含0.15 mol/L氯化钠的0.05 mol/L的Tris-HCl溶液（pH9.0）为流动相，流速0.5 mL/min，柱温为室温，检测波长280 nm。结果：在280 nm下，2种rUOX在200~1000μg/mL浓度范围内线性关系良好（r2分别为1和0.9999），其高、中、低平均回收率均较高，为98.33%~99.96%。结论：本方法专属性、精密度和准确性良好，可作为PEG-rUOX的含量测定方法。

重组链激酶与尿酸氧化酶治疗急性心肌梗死的疗效比较

目的 :比较重组链激酶和尿酸氧化酶治疗急性心肌梗死 (AMI)的疗效和安全性。方法 :选取符合急性心肌梗死患者 6 6例 ,分别给予尿酸氧化酶或重组链激酶 15 0万 U加入 0 .9%氯化钠 10 0 m L 中 ,30 m in内滴完 ,12 h后予低分子肝素皮下注射 ,观察溶栓疗效。结果 :再通率 :尿酸氧化酶组 6 2 .8% ,重组链激酶组 87.1% ;6 h再通率 :尿酸氧化酶组 75 % ,重组链激酶组 95 .6 % ,结果均有显著差异 ;副作用 :重组链激酶组主要为寒战 ,两组均有轻度出血。结论 :应用重组链激酶溶栓再通率高 。