免疫亲和层析纯化兔抗人IgG

用人IgG-Sepharose 4B亲和柱,3mol/L氯化镁洗脱,一步纯化免抗人IgG血清,获得了SDS-PAGE电泳纯,免疫双扩散法效价达1/256,收率62.6%;用8mol/L脲洗脱,效价为1/128,收率34.1%.与硫酸铵多步沉淀法比较,纯度和效价大大提高,为获得高度特异、高亲和力兔抗人IgG提供了一条简便途径.

大黄鱼血清IgM纯化及其兔抗血清的制备

分别用饱和硫酸铵二次盐析法和蛋白A亲和层析法对健康大黄鱼(Pseudosciaena crocea)血清中的免疫球蛋白(IgM)进行分离纯化,所得产物用SDS-PAGE进行检测。结果表明,蛋白A亲和层析法可以较好地分离到高纯度的大黄鱼血清IgM,产物的电泳胶中只有重链和轻链2个条带;饱和硫酸铵二次盐析法除了有这2个条带,还有很多杂带,而且蛋白A亲和层析法更为简便、快速,因此用蛋白A亲和层析法分离纯化IgM优于饱和硫酸铵二次盐析法;大黄鱼免疫球蛋白重链的分子量在76 kD左右;轻链分子量在28 kD左右。用纯化的大黄鱼IgM免疫实验兔,获得效价高达1∶40 960的兔抗鱼IgM血清。本实验所建立的蛋白A亲和层析法提取大黄鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。本研究所制备的兔抗大黄鱼IgM血清可为今后的相关研究工作打下基础。

兔源抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、抗体的制备及初步应用

为了原核表达兔源抗凋亡蛋白Bcl-2,并诱导表达纯化该蛋白后制备多抗,采用RT-PCR扩增Bcl-2编码序列,并将该序列克隆至pET-32a(+)载体,获得重组pET-32a-Bcl-2质粒转化BL21(DE3),筛选最佳表达条件,通过亲和层析纯化目的蛋白质,最后经Western blot鉴定后免疫小鼠。结果显示,成功扩增Bcl-2编码序列并构建了pET-32a-Bcl-2表达载体;SDS-PAGE结果显示,在16℃,5 h,0.5 mmol/L IPTG的表达条件下,重组蛋白Bcl-2能够高效可溶性表达;Western blot结果表明纯化后的表达产物为高纯度的Bcl-2重组蛋白,将该蛋白质免疫小鼠后获得了特异性抗体,该抗体能够特异性识别重组Bcl-2蛋白,并应用该抗体鉴定RK13-B细胞中Bcl-2蛋白的过表达。

草鱼血清IgM蛋白的纯化及抗血清的制备

采用盐析法、重组蛋白A(HiTrapr Protein A Sepharose)亲和层析法分离纯化草鱼血清中的IgM,并通过SDS-PAGE及Western-blot技术对纯化蛋白的部分特性进行分析比较并制备兔抗IgM抗血清。结果表明:33%硫酸铵溶液可以沉淀血清中大部分蛋白,但电泳条带仍较多,其中含有78kD和28kD的条带,因此仅可作为免疫球蛋白粗提的方法;而rProtein A亲和层析法所提蛋白则仅有上述重链(78kD)和轻链(28kD)。Western-blot显示,鼠抗人Ig抗体可与78kD及28kD条带发生发应。rProtein A亲和法提纯蛋白的纯度较高,但含量较低,条带较淡,仅可作为实验室小量提纯草鱼IgM的有效方法。将提纯的蛋白免疫实验兔后可制得效价高达1:25600的兔抗鱼IgM血清,并测得血清蛋白总量和IgM含量分别为25.87mg和4.5mg,IgM占血清蛋白总量的17.39%。本实验所采用的蛋白A亲和层析法提取草鱼血清IgM可以方便、快捷地获得高纯度的产物,适合在实验室中纯化鱼类IgM。同时本研究所制备的兔抗草鱼IgM血清也为今后的相关研究工作打下基础。

南美白对虾血蓝蛋白与抗人IgG相互作用的研究

以采自汕头的南美白对虾血清为研究对象, 运用Sephdex_75 柱层析、PAGE、Dot_ELISA、SDS_PAGE和Western_blotting等方法, 探索血蓝蛋白与抗人IgG之间的相互作用. 结果表明, 血蓝蛋白不仅可与兔抗虾血蓝蛋白抗血清发生特异性的结合, 也可与抗人IgG发生明显的交叉反应. 进一步研究显示, 血蓝蛋白表现为相对分子质量分别为75 kDa和73kDa的两个亚基, 其中75 kDa亚基与抗人IgG呈显著阳性, 表明, 血蓝蛋白75 kDa亚基与人Ig存在相似的抗原决定簇或高度同源的同源区域.

壳聚糖/明胶磁性微球的反相悬浮乳液包埋法制备研究

在油包水(W/O)体系中,采用反相悬浮乳液包埋法,以戊二醛为交联剂,实现了壳聚糖和明胶(Gs/Gel)微球对Fe3O4磁性粒子的包裹.其制备的磁性微球粒径在3～8μm范围,分散性和磁响应性良好;磁性微球可较好地吸附BSA和亲和层析兔抗β-CN IgG,对后者的吸附率在48h稳定后可达到42.75%,为实验室制备高质量免疫磁性微球奠定了基础.

两种病理类型肾病患者尿IgG对人肾小管上皮细胞表达巨噬细胞移动抑制因子的影响

目的分离纯化表现为肾病综合征(NS)的微小病变型(MCD)及膜性肾病(MN)患者尿IgG,比较它们对人近端小管上皮细胞(HK-2)表达巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的影响。方法采用硫酸铵沉淀、蛋白G亲和层析纯化尿中IgG,并经SDS-PAGE、Western印迹分析鉴定。用不同浓度(0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0mg/ml)的上述两种患者的尿IgG分别刺激HK-2细胞6h,应用RT-PCR检测细胞表达。MIFmRNA的变化:应用Western印迹检测细胞中MIF的蛋白水平。结果纯化的尿IgG经SDS—PAGE分析显示其分解为4个片段,以兔抗人IgG抗体进行免疫印迹鉴定,证实这些蛋白条带均为IgG成分。两种不同病理类型NS患者的尿IgG均可上调HK-2细胞MIF的基因及蛋白表达,并呈剂量依赖性。MN患者的尿IgG0.1mg/ml即可明显上调HK-2细胞.MIFmRNA和蛋白表达(P<0.01);而MCD患者的尿IgG需达到2.5mg/ml才具有显著上调效应。结论呈NS的MCD和MN患者尿IgG可上调HK-2细胞表达MIF。MN患者尿IgG的作用强于MCD患者,提示这两种不同病理类型患者尿IgG可能存在结构或功能上的差异。