层粘连蛋白α3在膝关节纤维化发生发展中的作用研究

目的:观察层粘连蛋白α3(LAMA3)在膝关节纤维化发生发展中的作用并探讨其作用机制。方法:制备兔膝关节纤维化动物模型,HE染色和Masson染色观察术区标本纤维化发展情况,免疫组化检测标本中LAMA3的表达。体外培养成纤维细胞,进行慢病毒转染,构建LAMA3过表达稳定细胞株。EdU染色观察LAMA3对成纤维细胞增殖的影响,Western blot检测LAMA3对细胞增殖相关蛋白的作用;Tunel染色观察LAMA3对成纤维细胞凋亡的影响,Western blot检测LAMA3对细胞凋亡相关蛋白的作用;Western blot检测成纤维细胞过表达LAMA3基因后,Wnt/β-catenin信号通路蛋白Wnt3a、p-GSK、β-catenin的表达;EdU染色观察Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939处理后细胞增殖能力的变化。结果:动物实验结果显示,随着术后时间的延长,膝关节纤维化程度加重,LAMA3表达随之增加。细胞实验结果显示,成纤维细胞过表达LAMA3后,细胞增殖能力增强,增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1表达增加。Tunel染色显示,成纤维细胞过表达LAMA3后细胞凋亡数量减少,且凋亡相关蛋白cleaved-PARP、Bax表达下调,而凋亡抑制蛋白Bcl-2表达上调。成纤维细胞过表达LAMA3后,Wnt3a、p-GSK、β-catenin蛋白表达上调,Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV-939处理后,LAMA3促进成纤维细胞增殖的作用明显减弱。结论:LAMA3可以促进成纤维细胞增殖,抑制其凋亡,从而促进膝关节纤维化,Wnt3a/β-catenin信号通路参与成纤维细胞增殖调控过程。

纤溶酶原Kringle 5与层粘连蛋白α3链G1结构域间的结合及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响

目的探究层粘连蛋白α3链G1结构域(LG1)是否为人纤溶酶原Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖和凋亡的影响。方法利用蛋白印记覆膜法(Blot overlay)及酶联免疫吸附试验(ELISA)技术考察重组Kringle 5与LG1间的结合能力;以紫杉醇作为阳性对照,不同浓度Kringle 5处理HUVEC;此外引入抗层粘连蛋白α3链抗体(抗LAMA3)并分成Kringle 5组(KR)、抗LAMA3+Kringle 5组(ALK)和Control组,细胞计数试剂盒(CCK-8)实验考察各组中内皮细胞的增殖和凋亡,组间比较采用单因素方差分析。结果Kringle 5可剂量依赖性地特异结合LG1,平衡解离常数为12.9×10^(-8) mol/L;细胞增殖实验中的Kringle 5处理组(180、260、340、420、500×10^(-9) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.59±0.03、0.48±0.02、0.36±0.04、0.25±0.01、0.25±0.01比0.72±0.01,F=52.211、340.650、187.178、3035.236、4044.002,P<0.05),且Kringle 5组(340、420、500×10^(-9) mol/L)的增殖抑制率高于紫杉醇组[(67.85±7.07)%、(87.15±2.28)%、(87.95±1.72)%比(48.04±7.84)%,F=10.561、68.783、74.115,P<0.05];细胞凋亡实验中,Kringle 5处理组(0.32、0.64、0.96、1.28、1.60、1.92×10^(-6) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.47±0.03、0.45±0.02、0.40±0.04、0.30±0.03、0.28±0.03、0.26±0.01比0.59±0.04,F=14.122、22.986、28.333、111.968、112.113、184.012,P<0.05);KR组的增殖抑制率高于ALK组[(29.95±2.85)%、(43.60±0.23)%、(55.61±3.87)%比(-11.28±4.46)%、(-22.30±16.19)%、(-18.42±17.82)%,F=181.953、49.667、49.438,P<0.05],KR组的细胞存活率低于ALK组[(93.80±19.17)%、(53.79±1.10)%、(47.10±13.90)%比(139.97±26.99)%、(150.41±33.67)%、(115.08±30.04)%,F=5.837、24.689、12.649,P<0.05]。结论层粘连蛋白α3链为Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对HUVEC的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。