纤溶酶原Kringle 5与层粘连蛋白α3链G1结构域间的结合及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响

目的探究层粘连蛋白α3链G1结构域(LG1)是否为人纤溶酶原Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖和凋亡的影响。方法利用蛋白印记覆膜法(Blot overlay)及酶联免疫吸附试验(ELISA)技术考察重组Kringle 5与LG1间的结合能力;以紫杉醇作为阳性对照,不同浓度Kringle 5处理HUVEC;此外引入抗层粘连蛋白α3链抗体(抗LAMA3)并分成Kringle 5组(KR)、抗LAMA3+Kringle 5组(ALK)和Control组,细胞计数试剂盒(CCK-8)实验考察各组中内皮细胞的增殖和凋亡,组间比较采用单因素方差分析。结果Kringle 5可剂量依赖性地特异结合LG1,平衡解离常数为12.9×10^(-8) mol/L;细胞增殖实验中的Kringle 5处理组(180、260、340、420、500×10^(-9) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.59±0.03、0.48±0.02、0.36±0.04、0.25±0.01、0.25±0.01比0.72±0.01,F=52.211、340.650、187.178、3035.236、4044.002,P<0.05),且Kringle 5组(340、420、500×10^(-9) mol/L)的增殖抑制率高于紫杉醇组[(67.85±7.07)%、(87.15±2.28)%、(87.95±1.72)%比(48.04±7.84)%,F=10.561、68.783、74.115,P<0.05];细胞凋亡实验中,Kringle 5处理组(0.32、0.64、0.96、1.28、1.60、1.92×10^(-6) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.47±0.03、0.45±0.02、0.40±0.04、0.30±0.03、0.28±0.03、0.26±0.01比0.59±0.04,F=14.122、22.986、28.333、111.968、112.113、184.012,P<0.05);KR组的增殖抑制率高于ALK组[(29.95±2.85)%、(43.60±0.23)%、(55.61±3.87)%比(-11.28±4.46)%、(-22.30±16.19)%、(-18.42±17.82)%,F=181.953、49.667、49.438,P<0.05],KR组的细胞存活率低于ALK组[(93.80±19.17)%、(53.79±1.10)%、(47.10±13.90)%比(139.97±26.99)%、(150.41±33.67)%、(115.08±30.04)%,F=5.837、24.689、12.649,P<0.05]。结论层粘连蛋白α3链为Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对HUVEC的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。

STGC3基因缺失突变对CNE2细胞生长增殖能力的影响

为探讨鼻咽癌候选抑癌基因STGC3中层粘连蛋白G结构域(LG domain)对CNE2生长增殖能力的影响,应用基因定点突变技术将该结构域缺失,亚克隆至真核表达载体上,并将野生型及突变型STGC3稳定转染人鼻咽癌细胞系CNE2,检测其对CNE2细胞系表型的影响,包括测定稳转细胞系的生长曲线、细胞集落形成能力和细胞周期分布.研究发现,LGdomain的缺失明显降低了STGC3的肿瘤抑制活性,使受其稳定转染的细胞系恶性度显著增强,提示该结构域在STGC3发挥肿瘤抑制功能中起着重要作用.