血清透明质酸、IV型胶原及层连蛋白检测的临床应用研究

用放免法检测３９例慢性乙型肝炎（下称慢乙肝）、４例慢乙肝肝硬化患者及１９例健康人肘血清透明质酸（ＨＡ）、ＩＶ型胶原（ＩＶ·Ｃ）和层连蛋白（ＬＮ）水平。结果表明，ＩＶ·Ｃ在轻度肝炎时即显著升高，较ＨＡ、ＬＮ灵敏；ＨＡ、ＩＶ·Ｃ和ＬＮ均与肝纤维化程度呈正相关，相关系数分别为０．６６７、０．７５７和０．４８６；单项检测以ＩＶ·Ｃ为最好，其对肝纤维化诊断的灵敏度、特异度、准确度分别为６２．５０％、５７．１４％、６１．２９％；血清ＨＡ水平升高还与门脉高压征关系密切（Ｐ＜０．００１）。

血清Ⅳ型胶原、层连蛋白和透明质酸检测对肝纤维化的诊断价值

本文检测了90例慢性肝炎、48例肝炎肝硬变患者血清Ⅳ型胶原(CL-Ⅳ),透明质酸(HA)和层连蛋白(LN)水平,并与30例正常人对照。结果慢性肝炎及肝硬变患者血清CL-Ⅳ、HA、LN水平随病情进展而逐渐升高。以CL-Ⅳ≥350ng/ml、HA≥300ng/ml、LN≥150ng/ml分别为诊断慢性肝炎肝纤维化的标准,其诊断灵敏度分别为88%、82%、72%;特异度分别为98%、98%、100%。说明三者不失为诊断肝纤维化较为敏感的指标,其中CL-Ⅳ对早期肝纤维化的诊断优于HA及LN。

人67KDa层连蛋白受体前体蛋白的基因克隆、表达及其免疫原性

［摘 要］目的 克隆、表达人67KDa层连蛋白受体前体蛋白（67KDa laminin receptor precursor，LRP）并检测其免疫原性。方法 应用RT－PCR从胃癌细胞9GC7901中扩增编码LRP的cDNA，将其按照T-A克隆法重组入pUCm－T载体并进行DNA序列测定。采用DNA重组技术构建原核表达载体pQE30-LRPP；用M15/pQE系统表达6×组氨酸与 LRP的融合蛋白，并以 SDS－PAGE和Western blot鉴定所获融合蛋白。用含融合蛋白的聚丙烯酸胺凝胶颗粒免疫小鼠，以 Westem blot检测小鼠血清的抗体活性。结果 DNA测序结果证实所扩增的cDNA片段与 LRP的基因序列完全相符。SDS－PAGE检测显示，经IPTG诱导2h后，M15/pQE30－LRP总蛋白中出现一条34KDa的新生蛋白带，Western blot进一步证实该新生蛋白为融合蛋白。其免疫小鼠血清经 Western blot检测仅识别SGC7901细胞中一条大小约为42KDa的蛋白带；其血清即使被稀释2000倍，仍然显示与靶蛋白有较强的结合活性。结论 成功地克隆、表达了人LRP，并具有良好的免疫原性。

肝病患者血清Ⅳ型胶原、透明质酸和层连蛋白联合检测分析

报告２０６例各型肝病患者血清Ⅳ型胶原（ＣＬ－Ⅳ）、透明质酸（ＨＡ）和层连蛋白（ＬＮ）联合检测分析及其临床意义探讨，并与３０例正常人对照。结果：肝病患者３项指标血清含量均随病情进展逐渐升高，尤以慢性肝炎和肝硬化升高显著（Ｐ＜０．０１）；以ＣＬ－Ⅳ、ＨＡ＞２００ｎｇ／ｍｌ、ＬＮ＞１２０ｎｇ／ｍｌ为慢性肝炎诊断临界值，诊断符合率分别为９３．３％、９１．１％、７３．３％；以ＣＬ－Ⅳ＞４５０ｎｇ／ｍｌ、ＨＡ＞５００ｎｇ／ｍｌ、ＬＮ＞２５０ｎｇ／ｍｌ为肝硬化诊断的临界值，符合率达８０％以上。分析认为，联合检测有助于慢性肝炎早期和肝硬化的诊断。

层连蛋白受体67LR在胶质瘤细胞增殖中作用的研究

脑胶质瘤是颅内常见恶性肿瘤,常规的治疗手段很难将其完全治愈。67 kD层连蛋白受体(67 kDlaminin receptor,67LR)属于高亲和,非整联蛋白家族成员,试验表明,该蛋白在许多癌细胞表面过量表达,并且其表达水平与肿瘤细胞的粘附、增殖、分化、迁移、信号转导及转移能力密切相关。本试验利用shRNA干扰、RT-PCR、免疫细胞化学和MTT等技术通过下调67LR基因的表达来探讨其在胶质瘤细胞中的表达情况,及其对胶质瘤细胞增殖能力的影响。结果发现,相对于正常脑组织,67LR在脑胶质瘤细胞表面大量表达。采用shRNA下调其表达后发现胶质瘤细胞的增殖能力明显降低。结果表明,67LR在胶质瘤细胞表面的过表达与此细胞的增殖能力呈明显相关。

层连蛋白受体及其与肿瘤转移的关系

层连蛋白受体及其与肿瘤转移的关系李慧芳谢弘（中国科学院上海细胞生物学研究所，上海２０００３１）关键词层连蛋白受体肿瘤转移肿瘤转移是一个复杂的多步连续过程，大致可概括地分为以下几个步骤：（１）恶性瘤细胞穿破基膜形成浸润灶；（２）脱落；（３）瘤细胞穿破脉...

层黏连蛋白基质在肿瘤细胞行为及血管生成拟态形成中的机制研究

血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)描述了肿瘤细胞在无内皮细胞参与下形成新的微循环模式的过程。临床上,VM与侵袭性表型和较差的患者生存率有关。以前的许多研究都集中在血管生成因子方面;最近的研究发现,肿瘤细胞周围的细胞外基质对肿瘤发展具有显著调控作用。细胞外基质蛋白质可能授予肿瘤细胞形成血管生成拟态的能力。在本研究中,我们研究了层黏连蛋白(laminin,LN)基质在黑色素瘤和骨肉瘤的肿瘤进程和VM形成中的作用。相较于Control组,高浓度LN基质培养下,肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移、干性表达和VM形成能力显著增强;利用免疫荧光染色和实时定量PCR分析其内在的分子机制,结果显示:与对照组相比,层黏连蛋白基质可以显著促进肿瘤细胞CD133的表达,同时E-钙黏着蛋白I的mRNA表达下调(P<0.05),而Integrin、N-cadherin、Vimentin以及Snail、Twist的mRNA表达上调(P<0.05)。以上研究结果表明,层黏连蛋白促进肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移和VM形成能力,并揭示了VM形成的潜在机制,为后期抗血管生成拟态的诊疗提供了新的思路。

红芪有效部位对肺间质纤维化模型大鼠肺组织胶原面积、透明质酸及层黏连蛋白的影响

目的观察红芪对肺间质纤维化模型大鼠肺组织胶原面积、透明质酸(HA)及层黏连蛋白(LN)表达的影响,探讨其作用机制,并筛选红芪最佳有效部位。方法将144只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、强的松组,以及红芪多糖、黄酮、皂苷的高、中、低剂量组。采用气管滴注博莱霉素法建立肺纤维化模型,从造模后第2日起,各药物组分别给予相应剂量药物,每日1次,共28 d。Masson染色观察肺组织胶原纤维的变化,放射免疫法检测各组大鼠肺组织匀浆中HA、LN含量。结果与模型组比较,红芪黄酮各剂量组、红芪多糖低剂量组肺泡炎明显减轻。红芪黄酮低剂量组、红芪多糖中剂量组、红芪皂苷低剂量组肺组织胶原面积明显减小。与模型组比较,红芪多糖高剂量组、红芪黄酮各剂量组、红芪皂苷高剂量组HA含量明显下降。红芪多糖高剂量组,红芪黄酮中、低剂量组,红芪皂苷中、低剂量组LN含量明显下降。结论红芪多糖、黄酮、皂苷在适宜剂量下均能减轻肺泡炎症,抑制胶原纤维增生、沉积,降低肺组织中HA、LN含量,其中红芪黄酮效果较佳。

健脾补土法对大鼠脑缺血再灌注后层黏连蛋白降解的影响

目的探讨健脾补土法对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞周围层黏连蛋白(LN)的降解机制及其脑保护作用。方法 38只大鼠随机分为:假手术组8只,模型组10只,健脾补土传统汤剂组10只,健脾补土超微剂型组10只,大脑中动脉栓塞再通法建立脑缺血再灌注模型。进行神经功能症状评分,脑组织病理形态学观察,采用TUNEL法检测凋亡神经元,免疫组织化学法检测LN和基质金属蛋白酶9(MMP-9)阳性表达。结果与假手术组比较,模型组神经功能症状评分、细胞凋亡指数、MMP-9阳性细胞表达数明显升高,LN表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较,健脾补土传统汤剂组和健脾补土超微剂型组神经功能症状评分、细胞凋亡指数、MMP-9阳性细胞表达数明显降低,LN表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 LN降解在脑缺血再灌注损伤中起重要作用,健脾补土法可能通过抑制MMP-9和减少LN降解减轻缺血再灌注所致神经元损伤。

Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和透明质酸酶在诊断肝纤维化程度中的应用

目的探讨在肝纤维化诊断中采用Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏连蛋白(LN)和透明质酸酶(HA)进行联合诊断的价值。方法选取2015年12月至2017年12月在该院就诊的病毒性肝炎及肝炎后肝硬化患者共80例(观察组)和80例健康献血者(对照组)作为研究对象。对所有研究对象采用化学发光法测定其血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA指标,并与病理检查结果结合分析其与肝纤维化程度之间的关系。结果肝炎患者的血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA指标显著升高,其中最高的为肝硬化患者;慢性肝炎患者的肝纤维化分期程度越严重,则PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA检查结果水平越高,两者呈正相关关系,不同肝纤维化分期之间各指标的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA水平与肝纤维化程度之间呈正相关关系,因此临床上可将血清PCⅢ、Ⅳ-C、LN以及HA指标作为反映肝纤维化严重程度的测量指标,在肝纤维化的早期诊断时作为重要的诊断依据。

胃癌组织中层黏连蛋白受体67LR和半乳糖凝集素-3蛋白的表达

目的:了解胃癌组织中67000层黏连蛋白受体(67LR)和半乳糖凝集素-3(Galectin-3)蛋白的表达情况。方法:用免疫组织化学SP法检测82例胃癌组织和20例胃癌手术远端切缘正常胃组织中67LR蛋白和Galectin-3蛋白的表达,并分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。结果:胃癌组织中67LR蛋白的阳性表达率为59.8%,Galectin-3蛋白的阳性表达率为84.1%,均高于相应的正常胃黏膜组织中的阳性表达率(30.0%和35.0%)。胃癌组织中67LR与Galectin-3蛋白的阳性表达率与患者的年龄、性别、Lauren分型无关;67LR蛋白的阳性表达率与胃癌的组织分化程度有关(P<0.05),Galectin-3蛋白的阳性表达率与胃癌的组织分化程度无关;有淋巴结转移的癌组织中两者的阳性表达率均高于无淋巴结转移组(P<0.05);随着肿瘤浸润深度的增加,两者的阳性表达率均明显增高(P<0.05)。胃癌组织中67LR与Galectin-3的表达呈正相关(P<0.05)。结论:67LR及Galectin-3蛋白阳性表达率与胃癌的侵袭、转移密切相关。

小鼠肾发育中层黏连蛋白表达的实验研究

目的观察层黏连蛋白(LN)在小鼠肾发育过程中的表达规律及层黏连蛋白与细胞极性的关系。方法用免疫组织化学链霉菌素亲和生物素-过氧化物酶连接法测定不同胚龄和日龄小鼠肾层黏连蛋白的表达。结果层黏连蛋白在肾组织中的表达随着胚龄增大和肾成熟程度而增加。在生后肾组织中的单个细胞、多个细胞无腔形成和多个细胞有腔形成时均有表达。在肾发育过程中层黏连蛋白表达于输尿管芽周围、肾小体基膜、肾小管基膜、肾小囊基膜和肾间质,且肾小管基膜着色早于肾小体基膜。结论在肾发生和成熟过程中,层黏连蛋白参与细胞极性的形成,层黏连蛋白的分布具有一定的时空顺序,对基膜的发生、成熟起重要作用。

川芎嗪对肺纤维化大鼠Ⅲ型胶原及层黏连蛋白的干预作用

目的研究川芎嗪注射液对博莱霉素A5致肺纤维化大鼠Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)及层黏连蛋白(LN)的干预作用。方法Wistar大鼠70只随机分为空白组、模型组、川芎嗪大剂量组(大剂量组)、川芎嗪中剂量组(中剂量组)、川芎嗪小剂量组(小剂量组)。除空白组外其他4组气管内注入博莱霉素A5造模,造模d2大、中、小剂量组每日开始腹腔注射川芎嗪注射液至28 d,剂量分别为250、150、40 mg/(kg.d)。检测d14、28时大鼠血清Col-Ⅲ、LN及d28时肺组织匀浆中以上指标,同时取肺组织行苏木精-伊红(HE)染色。结果肺纤维化大鼠d14、28时血清及肺组织匀浆Col-Ⅲ及LN水平明显升高,与空白组比较有显著差异(Pa<0.01);川芎嗪大、中剂量组能降低肺纤维化大鼠血清及肺组织匀浆中Col-Ⅲ及LN水平(P<0.01,0.05)。其中以川芎嗪大剂量组效果较为明显,川芎嗪小剂量组疗效较差。结论降低肺纤维化大鼠Col-Ⅲ及LN的水平,可能是川芎嗪注射液发挥治疗作用的机制之一。

施万细胞的层黏连蛋白表达变化及两者关系的初步研究

目的:观察层黏连蛋白(laminin,LN)在坐骨神经发育过程中的表达情况,以及LN和施万细胞(Schwann cells,SCs)的相互关系。方法:取E14、E17、P1和成年SD大鼠坐骨神经,免疫荧光组织化学染色检测LN表达情况;体外培养大鼠来源的SCs,经过外源性LN处理后,免疫荧光细胞化学染色检测LN、nidogen、type IVcollagen等细胞外基质成分的表达,酸性磷酸酶法检测SCs的黏附能力。结果:E17大鼠坐骨神经SCs有LN阳性免疫反应;经过外源性LN处理后,SCs有LN、nidogen、type IV collagen阳性免疫反应,且黏附能力增加。结论:在E17大鼠中,SCs开始分泌LN;LN具有促进SCs合成细胞外基质成分,并在其黏附过程中发挥作用。

乙酰肝素酶、层黏连蛋白及其受体的表达以及在卵巢癌转移中的作用

目的 :探讨乙酰肝素酶mRNA(acetyl heparanasemRNA)、层黏连蛋白 (laminin ,LN)及其受体 (lamininrecepter,LR) ,在 5 0例卵巢癌、33例淋巴结转移卵巢癌及 10例浆液性囊腺瘤中的表达 ,及其在卵巢癌转移中的作用。方法 :应用原位杂交和免疫组化染色方法 ,检测乙酰肝素酶mRNA转录水平及LN和LR的蛋白的表达及定位。结果 :乙酰肝素酶mRNA在卵巢癌病灶及转移淋巴结中的转录水平明显增强 ,原发灶与转移灶之间的表达差异显著 (P <0 .0 5 ) ,恶性肿瘤与良性肿瘤之间表达的差异更为明显 (P <0 .0 1)。LN在癌组织及转移淋巴结中的表达少 ;而LR的表达却明显增强。乙酰肝素酶mRNA与LN表达呈负相关 ,与LR的表达呈正相关。结论 :乙酰肝素酶mRNA的表达与LN和LR的表达之间分别呈正、负相关性 ,提示乙酰肝素酶是参与肿瘤的生长。

层黏连蛋白和纤维连接蛋白对传代人晶状体上皮细胞生长和Cx43表达的影响

目的:观察层黏连蛋白(Ln)和纤维连接蛋白(Fn)对传代培养的人晶状体上皮细胞(hLECs)形态学和连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法:以层黏连蛋白(Ln)和纤维连接蛋白(Fn)处理培养皿表面,以倒置显微镜观察第3代培养的hLECs生长的形态,MTT法记录其生长曲线,免疫荧光法检测Cx43表达,比较两组表达阳性率的变化。结果:在层黏连蛋白处理组,传代细胞以典型的六角形上皮细胞形态为主,而纤维连接蛋白处理组则表现为以梭形的成纤维细胞为主。MTT实验显示,传代后4～7d纤维连接蛋白处理组细胞数多于层黏连蛋白处理组(P<0.05)。免疫荧光反应中,两组Cx43表达的阳性率有明显差别(23/28vs16/28,P<0.05)。结论:层黏连蛋白可以提供适宜hLECs保持上皮细胞状态的体外培养微环境,而纤维连接蛋白可以促进hLECs的增殖和分化。

抗人层黏连蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人层黏连蛋白(laminin,LN)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:以人LN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人的mAb;同时采用间接ELISA法柃测mAb的腹水效价及mAb的相对亲和力;采用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、进行表位分析及特异性鉴定。结果:获得4株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞2A3、2C6、3G7和4H2,其腹水mAb 的效价为3.6 × 104～2.1×106;4株mAb的Ig亚类为IgG1,轻链均属κ型;相对亲和力2C6在1012以上,2A3、3G7和4H2在106以上;其中2株与1个表位结合,另2株与另外的1个表位结合。结论:成功地制备出抗人LN的mAb,为进一步研究LN在一些疾病中的作用提供了工具。

高糖对人肾小球系膜细胞细胞间黏附分子-1及层黏连蛋白表达的影响

目的探讨高糖对人肾小球系膜细胞表达细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,I-CAM-1)及层黏连蛋白(laminin,LN)的影响。方法将培养的人肾小球系膜细胞分为正常糖对照组、高糖组和甘露醇对照组,分别在24、48、72h收集培养液上清,采用ELISA法检测上清液中ICAM-1和LN的表达。结果人肾小球系膜细胞表达ICAM-1在24h开始升高,48h达高峰,72h下降。LN表达呈时间依赖性。且高糖组ICAM-1及LN的表达显著高于正常糖对照组及甘露醇组(P<0.05),正常糖对照组与甘露醇组对比ICAM-1及LN的表达差异无显著性(P>0.05)。结论高糖可导致人肾小球系膜细胞ICAM-1及LN表达增加。I-CAM-1对肾脏可能具有炎性损伤作用,LN的增加表明肾小球系膜外基质的过度表达,二者均可促进糖尿病肾病的发生发展。从而为糖尿病肾病的治疗提供了新靶点。

整合素α1、层黏连蛋白和IL-1α在大鼠肝再生过程中的表达变化

目的 通过检测整合素α1、层黏连蛋白 (LN)和IL 1α在大鼠肝再生过程中的表达变化 ,探讨肝细胞增殖的机制。 方法 SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组和实验组。切除实验组大鼠 2 3肝 ,分别于术后不同时段取肝 ,以免疫组织化学方法检测肝组织中整合素α1和LN的表达变化 ,以ELISA方法测定肝组织和库普弗细胞内IL 1α的含量变化。 结果 1 整合素α1定位于肝细胞膜和细胞质 ,术后 4h其免疫反应阳性肝细胞数开始增多 ,2 4～ 36h达高峰 ,1 4 4h后恢复正常 (P <0 0 1 ) ;2 肝内LN免疫反应阳性面积于 1 2h开始增加 ,2 4～ 4 8h达高峰 ,术后 1 2h阳性肝细胞数增多 ,以 2 4～ 36h最多 (P <0 0 1 ) ,96h后恢复正常 ;3 IL 1α在肝组织中的含量于术后 1h开始升高 ,3h达高峰 ,4h后低于正常并持续至 1 4 4h(P <0 0 1 ) ,在库普弗细胞内的含量于术后 0 5h开始升高 ,1 5～ 4h维持在高峰 ,1 2h后低于正常并持续至 96h(P <0 0 1 )。 结论 库普弗细胞分泌的IL 1α可能是肝再生早期刺激肝细胞增殖的信号分子之一 ,肝再生期间肝细胞与细胞外基质之间的黏附过程可能与整合素α1和LN有关。