屋尘螨抗原Derp2基因的克隆和表达

目的 构建并克隆屋尘螨抗原 Der p2基因 ,在大肠杆菌中初步表达 .方法 根据已发表的 Der p2基因 ,人工设计合成一系列基因片段 ,经单链扩增后连接成完整的 Der p2基因 ;将该基因克隆入表达载体 p Pro EX HTb中 ,测序并进行初步表达 .结果 利用所设计的结构制备了完整的 Der p2基因 ,以大肠杆菌为宿主在 IPTG的诱导下获得初步表达 ,该外源蛋白 Mr约为 17× 10 3,占总蛋白量的 2 0 % .结论 所构建的 Der

屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌的构建及其鉴定

目的构建并鉴定能够分泌表达外源蛋白——屋尘螨抗原(Der p2)的基因重组耻垢分枝杆菌(rM.s)。方法采用电穿技术,将鉴定好的PCW-Der p2质粒转化到耻垢分枝杆菌(M.s),通过PCR鉴定目标基因在rM.s中的表达。结果经PCR鉴定,成功将PCW-Der p2质粒转化到M.s。结论成功构建了以分泌方式表达外源蛋白的Der p2-rM.s。

PM2.5颗粒协同屋尘螨抗原Der p1在小儿哮喘发作中的机制分析

目的 :研究PM2.5颗粒协同屋尘螨抗原Der p1在小儿哮喘发作中的作用。方法 :96例哮喘发作患儿随机分为PM2.5组、屋尘螨组、协同组和对照组各24例,对比临床效果。结果 :对照组哮喘控制率显著高于PM2.5组和屋尘螨组,协同组最低;控制时间最短,其次为PM2.5组和屋尘螨组组,协同组最长(P<0.05)。干预后各组肺功能FVC、FEV1和PEF水平较前增加,且对照组明显高于PM2.5组和屋尘螨组,协同组最低(P<0.05)。治疗后对照组血清IL-25、TSLP和丙二醛含量明显降低,而其他三组明显升高(P<0.05)。结论 :PM2.5颗粒和屋尘螨抗原Der p1可通过炎症反应和氧化应激影响小儿哮喘的治疗效果。

屋尘螨抗原致敏大鼠支气管上皮细胞白介素6、白介素8和转化生长因子β1的表达

目的探讨屋尘螨抗原（Derpl）对大鼠原代支气管上皮细胞白介素6（IL-6）、IL-8和转化生长因子β1（TGF—β1）表达的影响。方法将实验随机分成正常对照组和实验组，实验组中细胞分别暴露于3个不同的Derpl浓度（1、5、10mg，／L）及3个不同的培养时间点（4、8和24h）。然后用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）及酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测细胞及细胞上清液中IL-6、IL-8和TGF-β1的表达及含量。结果与对照组相比，实验组各指标有明显变化。Derpl刺激4h，IL-6和IL-8表达开始升高，直至8～24h呈高水平。而在Derpl浓度≥5mg／L条件下，IL-6和IL-8表达最明显，与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。而TGF—β1则随着时间和浓度的增加，其表达水平呈逐渐上升趋势，各时间点的表达差异均有统计学意义（P〈O．05）。各炎症指标（IL-6，IL-8，TGF-β1）ELISA结果与PCR趋势基本一致。结论Derpl刺激气道上皮细胞，引起支气管上皮细胞免疫反应，释放一系列炎症因子如IL-6、IL-8和TGF-β1，从而参与哮喘气道炎症反应及哮喘的气道重塑。

血清人屋尘螨特异性Ⅰ类抗原IgE浓度与儿童哮喘急性发作的相关性分析

目的探讨哮喘儿童血清人屋尘螨特异性Ⅰ类抗原(dermatophagoides pteronyssinus allergen componentsⅠ,Der p1)IgE浓度与儿童哮喘急性发作的相关性。方法采用病例对照研究方法,选取2018年6-10月及2019年6-10月两个时间段内在徐州医科大学附属徐州儿童医院呼吸内科住院的52例尘螨致敏的急性发作期哮喘患儿作为哮喘组,选取同期52名性别、年龄与哮喘组匹配的健康儿童作为健康对照组。另根据≥6岁儿童哮喘急性发作期病情严重程度分级标准将哮喘患儿分为轻度-中度组33例,重度-危重组19例。采用酶联免疫吸附法检测所有研究对象的血清Der p1 IgE浓度,比较两组研究对象血清Derpl IgE浓度及不同严重程度的哮喘急性发作患儿血清Der p1 IgE浓度的差异。Logistic回归分析血清Der p1 IgE浓度与儿童哮喘急性发作的相关性。结果哮喘组血清Der p1 IgE浓度为(409.63±51.50)×103 IU/L,明显高于健康对照组(314.44±8.75)×103 IU/L,差异有统计学意义(t′=13.139,P<0.01)。轻度-中度组和重度-危重组哮喘患儿血清Der p1 IgE浓度分别为(385.81±14.75)×103、(451.00±65.45)×103 IU/L,两组之间差异具有统计学意义(t′=4.279,P<0.01)。Logistic回归分析显示,血清Der p1 IgE浓度与儿童哮喘急性发作具有相关性(回归系数1.322,OR=3.596,95%CI 2.874~8.957,P=0.003)。结论哮喘急性发作期患儿血清Der p1 IgE表达水平较健康儿童升高,提示血清Der p1 IgE可能参与了尘螨致敏的哮喘患儿的急性发作过程。

胞壁表达Der p2的重组BCG对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响

目的:观察接种以膜蛋白形式表达屋尘螨抗原Der-p2基因的重组BCG(rBCG),对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响。方法:以生理盐水为对照,分别将rBCG和BCG经腹腔注射接种于6～8wk龄和新生BALB/c小鼠,用ELISA法测定小鼠血清、脾脏T细胞培养上清(STLCS)中IL4、IFN-γ水平,用双色荧光标记流式细胞仪法测定脾脏细胞Th细胞亚群。结果:接种rBCG和BCG后,成年和新生小鼠血清和STLCS中IL4水平较对照组显著降低、IFN-γ水平显著升高;无论成年鼠还是新生鼠,在CD4+的脾脏细胞中,IFN-γ+细胞的比例明显升高,而IL4+细胞比例明显降低;此外,在两个年龄组小鼠,接种rBCG者脾细胞均产生了较BCG组更高水平的IFNγ;同时,用rBCG免疫的两组小鼠脾脏CD4+IFN-γ+的细胞比例也明显高于BCG免疫各组。结论:无论rBCG还是BCG通过腹腔注射免疫,均可诱导不同年龄BALB/c小鼠产生Th1免疫应答;表达在rBCG细胞壁上的Derp2被当成BCG的成分,为机体免疫系统所识别,抗原再次接触进一步刺激了Derp2特异性的Th1应答。这些结果表明,胞壁型抗原重组BCG可作为有效的疫苗,特异性地调节Th1/Th2平衡。

HLA-DRB1、DQB1基因与汉族哮喘的相关性研究

探讨 HL A- DRB1、DQB1位点基因在中国汉族哮喘家系中与哮喘的相关性。用序列特异性引物 -聚合酶链反应 (PCR- SSP)方法 ,对 10 1例哮喘家系成员和 6 0例正常对照者进行了 HL A- DRB1、DQB1等位基因的分型 ,并分析了 DRB1、DQB1基因在两组中的分布。结果示 ,与正常对照组比较 ,哮喘患者组 DRB1* 15等位基因频率 (2 0 .93% )较正常对照组 (6 .6 7% )明显增高 (χ2 =10 .95 ,P<0 .0 5 ) ;DQB1* 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组(31.4 0 % )较正常对照组 (7.5 % )明显增高 (χ2 =2 3.0 8,Pc<0 .0 1)。同时发现 HL A- DRB1* 0 7等位基因频率在对屋尘螨抗原皮试阳性家系成员中 (2 7.4 2 % )较家系中皮试阴性者 (5 .36 % )显著增高 (χ2 =10 .83,Pc<0 .0 5 )。HL A- DRB1* 15和 DQB1* 0 6 0 1可能是汉族哮喘的遗传等位易感基因 ,HL A- DRB1* 0 7在限定对屋尘螨抗原特异性 Ig

特应性皮炎与HLA-DRB1 DQB1基因的相关性研究

目的探讨HLA-DRB1和DQB1位点基因与汉族特应性皮炎的相关性。方法用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法,对59例特应性皮炎患者(来自27个家系)和60例正常对照者进行了HLA-DRB1和DQB1等位基因的分型,并分析了DRB1和DQB1基因在各组中的分布。结果特应性皮炎患者组DRB1*15,DR7,DQB1*0601等位基因频率较正常对照组增高(P<0.05);特应性皮炎患者组DQB1*0302频率较正常对照组降低(P<0.05)。特应性皮炎家系成员中对屋尘螨抗原皮试阳性者HLA-DR7等位基因频率较皮试阴性者均显著增高(P<0.05)。结论特应性皮炎的发病可能与DRB1*15,DR7,DQB1*0601相关;DQB1*0302对特应性皮炎的发病可能起保护作用。HLA-DR7在限定对屋尘螨抗原特异性IgE反应过程中起重要作用。

胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定

利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1。将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆。阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因。用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定。结果成功扩增了Derp2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功。说明成功地构建了胞壁表达Derp2-PEB1融合蛋白重组BCGpCW-Der p2-PEB1-rBCG。为基因工程疫苗的研制奠定了基础。

胞壁型rBCG经口服免疫可以诱导BALB／c小鼠产生抗原特异性TH1应答

目的 观察胞壁型重组BCG（rBCG）经口服接种后对BALB／c小鼠TH细胞免疫应答的影响。方法 以100ml／L甘油为对照，分别将BCG和以膜蛋白形式表达屋尘螨抗原Derp2的rBCG经口服接种于8周龄BALB／c小鼠，109CFU／d，连续5d，用夹心EIASA测定小鼠血清、脾脏T淋巴细胞培养上清（SCS）和肠道相关淋巴细胞培养上清（GGS）中IL-4、IFN-γ水平，用双色荧光标记-流式细胞术测定脾脏淋巴细胞（SLC）和肠道相关淋巴细胞（GLC）中TH细胞亚群。结果免疫4周后，ELISA结果表明：BCG和rBCG两组血清和SCS的IFN-γ水平较对照组升高，IL-4水平降低；但两组小鼠GCS仅见IFN-γ水平升高。流式细胞测定结果表明：在CD4^＋的SLC中，BCG和rBCG免疫小鼠的IDl2R黠细胞比例升高，而CD30^＋细胞比例降低；在CD4^＋的GLC中，BCG和rBCG免疫小鼠的IFN-γ^＋细胞比例升高；至免疫后8周，上述改变进一步明显，但BCG和rBCG两组之间差异无统计学意义。体外给予抗原刺激后，rBCG组小鼠变化更加显著，而BCG组则无明显改变。但GCS的IL-4水平始终无法测得；同时GLC中IL-5^＋细胞比例仍持续较低。结论无论rBCG还是BCG通过口服免疫，均可诱导BALB／c小鼠产生TH1优势免疫应答；而胞壁型Derp2-rBCG诱导产生的TH1优势应答具有Der p2抗原特异（记忆）性。

HLA-DQ等位基因与哮喘相关性研究

目的 探讨在中国汉族哮喘家系中 ,HLA DQ基因与哮喘的相关性。方法 对 98例哮喘家系成员 ,用PCR 序列特异性引物 (PCR SSP)技术对HLA DQA1和B1进行基因分型 ,并与正常对照进行比较。结果 发现DQA1 0 10 1和DQA1 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组 (4 0 0 % ,45 0 % )较正常对照组 (16 4% ,13 4% )显著升高 (χ2 =6 186 0 ,P <0 0 5 ,RR =3 39;χ2 =11 6 0 90 ,P <0 0 1,RR =5 2 7) ;DQB1 0 30 3和DQB1 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组 (5 5 0 % ,47 5 % )较正常对照组 (13 7% ,13 7% )显著升高 (χ2 =15 740 0 ,P <0 0 1,RR =7 6 8;χ2 =10 930 0 ,P <0 0 1,RR =5 6 9)。同时发现HLA DQB1 0 2 0 1等位基因频率在对屋尘螨抗原特异性IgE反应哮喘家系成员 (39 4% )较家系中非特应症者 (12 0 % )显著高频表达 (t =2 382 5 ,P <0 0 5 )。结论 HLA DQA1 0 10 1, 0 6 0 1和DQB1 0 30 3, 0 6 0 1是哮喘遗传易感等位基因 ;HLA DQB1 0 2 0

沙门菌Omp D介导的rBCG口服疫苗的制备与鉴定

目的利用重组BCG（rBCG）技术，构建能以串联和并联形式、在细菌表面表达Derp2和OmpD抗原的两种rBCGLI服疫苗。方法经PCR法分别扩增获得Derp2和OmpD基因，测序正确后将两者克隆人原核表达载体pProEXHTb，获得pProEXHTb-De．rp2-OmpD质粒。①串联表达：将Derp2-OmpD融合基因亚克隆人穿梭胞壁表达载体pCW，经酶切鉴定阳性命名为pCW-Derp2-OmpD质粒。将此重组质粒电穿导人BCG感受态细胞，构建可胞壁串噘表达Derp2-OmpD融合蛋白的rBCG；②并联表达：构建pCW-Derp2与pCW-OmpD两种质粒，井将二者同时电穿导人BCG感受态细胞，以构建胞壁并联表达Derp2和OmpD蛋白的rBCG。经潮霉素抗性筛选的阳性克隆，均采用以下三种方式进行鉴定：PCR特异性扩增目的基因片段；用兔抗Derp2多克隆抗体与兔抗OmpD多克隆抗体对阳性克隆分别进行斑点免疫杂交法和间接免疫荧光法鉴定。结果采用基因工程手段制备出以胞壁形式串联和并联表达Derp2和OmpD蛋白的两种rBCG口服疫苗，并通过PCR、斑点免疫杂交法及间接免疫荧光法分别进行鉴定。结论两种rBCG口服疫苗构建成功，为体外实验和临床应用提供基础。

变应性鼻炎特异性IgE抗体的测定

本文采用ＥＬＩＳＡ法对常年性变应性鼻炎，屋尘抗原皮肤试验示阳性反应的３６例患者，血清中屋尘特异性ＩｇＥ抗体了测定。３６例中特异ＩｇＥ抗体阳性２３例占６４％，皮肤试验反应强度与特异ＩｇＥ抗体之间无相关。ＥＬＩＳＡ法特异性高，特异ＩｇＥ抗体阳性时便可确定变应原，临床上有很大应用价值。