屋尘螨抗原Derp2基因的克隆和表达

目的 构建并克隆屋尘螨抗原 Der p2基因 ,在大肠杆菌中初步表达 .方法 根据已发表的 Der p2基因 ,人工设计合成一系列基因片段 ,经单链扩增后连接成完整的 Der p2基因 ;将该基因克隆入表达载体 p Pro EX HTb中 ,测序并进行初步表达 .结果 利用所设计的结构制备了完整的 Der p2基因 ,以大肠杆菌为宿主在 IPTG的诱导下获得初步表达 ,该外源蛋白 Mr约为 17× 10 3,占总蛋白量的 2 0 % .结论 所构建的 Der

PM2.5颗粒协同屋尘螨抗原Der p1在小儿哮喘发作中的机制分析

目的 :研究PM2.5颗粒协同屋尘螨抗原Der p1在小儿哮喘发作中的作用。方法 :96例哮喘发作患儿随机分为PM2.5组、屋尘螨组、协同组和对照组各24例,对比临床效果。结果 :对照组哮喘控制率显著高于PM2.5组和屋尘螨组,协同组最低;控制时间最短,其次为PM2.5组和屋尘螨组组,协同组最长(P<0.05)。干预后各组肺功能FVC、FEV1和PEF水平较前增加,且对照组明显高于PM2.5组和屋尘螨组,协同组最低(P<0.05)。治疗后对照组血清IL-25、TSLP和丙二醛含量明显降低,而其他三组明显升高(P<0.05)。结论 :PM2.5颗粒和屋尘螨抗原Der p1可通过炎症反应和氧化应激影响小儿哮喘的治疗效果。

屋尘螨抗原Der p2重组耻垢分枝杆菌的构建及其鉴定

目的构建并鉴定能够分泌表达外源蛋白——屋尘螨抗原(Der p2)的基因重组耻垢分枝杆菌(rM.s)。方法采用电穿技术,将鉴定好的PCW-Der p2质粒转化到耻垢分枝杆菌(M.s),通过PCR鉴定目标基因在rM.s中的表达。结果经PCR鉴定,成功将PCW-Der p2质粒转化到M.s。结论成功构建了以分泌方式表达外源蛋白的Der p2-rM.s。

屋尘螨Ⅰ类变应原Der p1的体内定位

对过敏性疾病主要过敏原屋尘螨Dermatophagoides pteronyssinusⅠ类变应原(Der p1)进行了抗原定位研究。选用经表达和纯化的Der p1抗原蛋白,按常规方法免疫小鼠,分离血清获抗重组Der p1的抗体(Ⅰ抗),用抗鼠IgG荧光抗体为Ⅱ抗,屋尘螨经石蜡切片,在荧光显微镜下对其特异性变应原的定位进行观察。HE染色显示屋尘螨消化系统占据大部分体腔。组织免疫荧光发现屋尘螨Ⅰ类变应原主要定位于螨的中肠组织及肠内容物,而螨的生殖系统、排泄系统等脏器以及几丁质甲壳均呈阴性反应。据此认为屋尘螨Ⅰ类变应原存在于螨的肠内容物和中肠组织中。

屋尘螨特异性变应原的定位研究

目的 探讨过敏性疾病主要变应原屋尘螨特异性抗原的定位。 方法 选用屋尘螨过敏患者的阳性血清特异性IgE抗体作探针 ,制作屋尘螨石蜡切片 ,HE染色后光镜观察其内部形态结构 ,免疫组织化学染色分析其特异性抗原定位。 结果与结论 内部形态结构 ,消化系统占据大部分体腔 ,可见口咽部、前中肠 (胃 )、中肠、后中肠等结构。中肠 (尤其是后中肠 )见明显的粪便颗粒 ,体腔见生殖腺等器官。免疫组织化学染色 ,见雌、雄屋尘螨的多种组织抗原定位均呈阳性反应 ,其特异性抗原主要定位于口咽部。

单一屋尘螨特异性免疫治疗变应性鼻炎的免疫机制探讨

目的:探讨单一屋尘螨变应原疫苗(简称,阿罗格)特异性免疫治疗常年性变应性鼻炎的疗效、安全性及可能机制。方法:常年性变应性鼻炎(Perennial allergic rhinitis,PAR)患者30例,其中对屋尘螨呈强阳性的患者18例(A组),对花粉、真菌等呈强阳性的患者12例(B组),健康对照组20例,对比观察各组阿罗格特异性免疫治疗变应性鼻炎前后症状、体征、临床疗效,同时检测血清IL-4、IL-10、IFN-γ、TGF-β1和特异性IgE(sIgE)等免疫学指标的变化情况。结果:⑴30例PAR患者,特异性免疫治疗后总有效率83.3%(25例),显效率60.0%(18例),无效率6.0%(2例)。⑵30例常年性变应性鼻炎患者共进行990次脱敏治疗,1例发生全身反应,共发生2次,总发生率0.2%(2/990),14例发生局部反应,共发生14次,总发生率1.4%(14/990),局部和全身反应均较轻。⑶与治疗前相比,治疗后血清IFN-γ、TGF-β1治疗后升高,但没有恢复到健康对照组水平,较健康对照组低;而IL-4、IL-10降低,但比健康对照组高;sIgE较治疗前明显下降,治疗前后各项指标比较均有统计学意义(P<0.01)。但A组、B组各项指标比较,无统计学意义(P>0.05)。结论:阿罗格屋尘螨变应原特异性免疫治疗变应性鼻炎是一种安全有效的方法,能调节变应性鼻炎患者体内Th1/Th2细胞因子的失平衡状态,并可能与血清中其他特异性抗体发生交叉抗原反应,这为变应性鼻炎免疫治疗提供了理论依据。

屋尘螨粗提液与屋尘螨标准化抗原的皮肤试验比较

目的 比较屋尘螨抗原的不同检测方法的差别 ,找到较合适的致敏原检测方法。方法 随机选取 95例变应性疾病的患者分别作屋尘螨粗提液的皮内试验、点刺试验、丹麦ALK公司的屋尘螨标准化抗原点刺试验及血清sIgE(PharmaciaUniCAP)的检测。结果 ① 95例患者屋尘螨过敏阳性率最高的是sIgE ,检测结果 70 .5 3% ,粗提液皮内试验 6 8.4 2 % ,标准化抗原点刺试验 6 5 .2 0 % ,最低的是粗提液点刺试验 5 7.89%。② 4种检测方法有显著相关性 (P <0 .0 5 ) ;而粗提液的点刺试验与皮内试验有显著差异 (P <0 .0 5 ) ,与血清sIgE也有显著差异 (P <0 .0 5 ) ;其余各方法之间无显著差异。结论 粗提液点刺试验的阳性率偏低 ,而皮内试验更接近标准化抗原点刺试验及sIgE的检测结果 ,在我国仍未抗原标准化的情况下 。

屋尘螨抗原致敏大鼠支气管上皮细胞白介素6、白介素8和转化生长因子β1的表达

目的探讨屋尘螨抗原（Derpl）对大鼠原代支气管上皮细胞白介素6（IL-6）、IL-8和转化生长因子β1（TGF—β1）表达的影响。方法将实验随机分成正常对照组和实验组，实验组中细胞分别暴露于3个不同的Derpl浓度（1、5、10mg，／L）及3个不同的培养时间点（4、8和24h）。然后用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）及酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测细胞及细胞上清液中IL-6、IL-8和TGF-β1的表达及含量。结果与对照组相比，实验组各指标有明显变化。Derpl刺激4h，IL-6和IL-8表达开始升高，直至8～24h呈高水平。而在Derpl浓度≥5mg／L条件下，IL-6和IL-8表达最明显，与正常对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。而TGF—β1则随着时间和浓度的增加，其表达水平呈逐渐上升趋势，各时间点的表达差异均有统计学意义（P〈O．05）。各炎症指标（IL-6，IL-8，TGF-β1）ELISA结果与PCR趋势基本一致。结论Derpl刺激气道上皮细胞，引起支气管上皮细胞免疫反应，释放一系列炎症因子如IL-6、IL-8和TGF-β1，从而参与哮喘气道炎症反应及哮喘的气道重塑。

血清人屋尘螨特异性Ⅰ类抗原IgE浓度与儿童哮喘急性发作的相关性分析

目的探讨哮喘儿童血清人屋尘螨特异性Ⅰ类抗原(dermatophagoides pteronyssinus allergen componentsⅠ,Der p1)IgE浓度与儿童哮喘急性发作的相关性。方法采用病例对照研究方法,选取2018年6-10月及2019年6-10月两个时间段内在徐州医科大学附属徐州儿童医院呼吸内科住院的52例尘螨致敏的急性发作期哮喘患儿作为哮喘组,选取同期52名性别、年龄与哮喘组匹配的健康儿童作为健康对照组。另根据≥6岁儿童哮喘急性发作期病情严重程度分级标准将哮喘患儿分为轻度-中度组33例,重度-危重组19例。采用酶联免疫吸附法检测所有研究对象的血清Der p1 IgE浓度,比较两组研究对象血清Derpl IgE浓度及不同严重程度的哮喘急性发作患儿血清Der p1 IgE浓度的差异。Logistic回归分析血清Der p1 IgE浓度与儿童哮喘急性发作的相关性。结果哮喘组血清Der p1 IgE浓度为(409.63±51.50)×103 IU/L,明显高于健康对照组(314.44±8.75)×103 IU/L,差异有统计学意义(t′=13.139,P<0.01)。轻度-中度组和重度-危重组哮喘患儿血清Der p1 IgE浓度分别为(385.81±14.75)×103、(451.00±65.45)×103 IU/L,两组之间差异具有统计学意义(t′=4.279,P<0.01)。Logistic回归分析显示,血清Der p1 IgE浓度与儿童哮喘急性发作具有相关性(回归系数1.322,OR=3.596,95%CI 2.874~8.957,P=0.003)。结论哮喘急性发作期患儿血清Der p1 IgE表达水平较健康儿童升高,提示血清Der p1 IgE可能参与了尘螨致敏的哮喘患儿的急性发作过程。

屋尘螨的人工饲养与临床测试的研究

目的 屋尘螨是国际公认的最强的致敏原 ,国外已有丹麦、美国等发达国家饲养成功 ,产品已经商品化 ,我国尚无屋尘螨饲养成功的报道 ,因而从 1990年起我科试行人工饲养 ,于 1996年底获得初步成功 ,收集到小批量的纯屋尘螨。方法 摸索屋尘螨在人工饲养下的生态条件及能使屋尘螨繁殖生长的饲料配方 ,将人工饲养的屋尘螨经专家鉴定确定为屋尘螨后 ,收集制成干粉 ,浸泡制成纯屋尘螨抗原浸液供临床测试。结果 用人工饲养的屋尘螨抗原 ,在变态反应的门诊病人中与粉尘螨浸液同时作皮内试验 ,共检测 110 3名各类变态反应疾病的病人 ,结果屋尘螨的皮试总阳性率为 6 4 .4 6 % ,粉尘螨的总阳性率为 5 8.2 9% ,P <0 .0 0 5。检测病人血清中特异性IgE ,屋尘螨的总强度亦比粉尘螨高。结论 屋尘螨在我国已人工饲养成功 ,这对提高我国的变态反应疾病的诊疗水平有重要的意义 。

胞壁表达Der p2的重组BCG对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响

目的:观察接种以膜蛋白形式表达屋尘螨抗原Der-p2基因的重组BCG(rBCG),对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响。方法:以生理盐水为对照,分别将rBCG和BCG经腹腔注射接种于6～8wk龄和新生BALB/c小鼠,用ELISA法测定小鼠血清、脾脏T细胞培养上清(STLCS)中IL4、IFN-γ水平,用双色荧光标记流式细胞仪法测定脾脏细胞Th细胞亚群。结果:接种rBCG和BCG后,成年和新生小鼠血清和STLCS中IL4水平较对照组显著降低、IFN-γ水平显著升高;无论成年鼠还是新生鼠,在CD4+的脾脏细胞中,IFN-γ+细胞的比例明显升高,而IL4+细胞比例明显降低;此外,在两个年龄组小鼠,接种rBCG者脾细胞均产生了较BCG组更高水平的IFNγ;同时,用rBCG免疫的两组小鼠脾脏CD4+IFN-γ+的细胞比例也明显高于BCG免疫各组。结论:无论rBCG还是BCG通过腹腔注射免疫,均可诱导不同年龄BALB/c小鼠产生Th1免疫应答;表达在rBCG细胞壁上的Derp2被当成BCG的成分,为机体免疫系统所识别,抗原再次接触进一步刺激了Derp2特异性的Th1应答。这些结果表明,胞壁型抗原重组BCG可作为有效的疫苗,特异性地调节Th1/Th2平衡。

HLA-DRB1、DQB1基因与汉族哮喘的相关性研究

探讨 HL A- DRB1、DQB1位点基因在中国汉族哮喘家系中与哮喘的相关性。用序列特异性引物 -聚合酶链反应 (PCR- SSP)方法 ,对 10 1例哮喘家系成员和 6 0例正常对照者进行了 HL A- DRB1、DQB1等位基因的分型 ,并分析了 DRB1、DQB1基因在两组中的分布。结果示 ,与正常对照组比较 ,哮喘患者组 DRB1* 15等位基因频率 (2 0 .93% )较正常对照组 (6 .6 7% )明显增高 (χ2 =10 .95 ,P<0 .0 5 ) ;DQB1* 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组(31.4 0 % )较正常对照组 (7.5 % )明显增高 (χ2 =2 3.0 8,Pc<0 .0 1)。同时发现 HL A- DRB1* 0 7等位基因频率在对屋尘螨抗原皮试阳性家系成员中 (2 7.4 2 % )较家系中皮试阴性者 (5 .36 % )显著增高 (χ2 =10 .83,Pc<0 .0 5 )。HL A- DRB1* 15和 DQB1* 0 6 0 1可能是汉族哮喘的遗传等位易感基因 ,HL A- DRB1* 0 7在限定对屋尘螨抗原特异性 Ig

特应性皮炎与HLA-DRB1 DQB1基因的相关性研究

目的探讨HLA-DRB1和DQB1位点基因与汉族特应性皮炎的相关性。方法用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法,对59例特应性皮炎患者(来自27个家系)和60例正常对照者进行了HLA-DRB1和DQB1等位基因的分型,并分析了DRB1和DQB1基因在各组中的分布。结果特应性皮炎患者组DRB1*15,DR7,DQB1*0601等位基因频率较正常对照组增高(P<0.05);特应性皮炎患者组DQB1*0302频率较正常对照组降低(P<0.05)。特应性皮炎家系成员中对屋尘螨抗原皮试阳性者HLA-DR7等位基因频率较皮试阴性者均显著增高(P<0.05)。结论特应性皮炎的发病可能与DRB1*15,DR7,DQB1*0601相关;DQB1*0302对特应性皮炎的发病可能起保护作用。HLA-DR7在限定对屋尘螨抗原特异性IgE反应过程中起重要作用。

胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定

利用重组BCG技术,构建能以胞壁形式表达屋尘螨Der p2和PEB1抗原的重组BCG口服哮喘疫苗pCW-Der p2-PEB1-rBCG,以pCW-Der p2质粒和pUC-PEB1质粒DNA为模板扩增基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1。将重组质粒电穿导入BCG感受态细胞,潮霉素抗性筛选rBCG阳性克隆。阳性rBCG经PCR特异性扩增目的基因片段Der p2及PEB1,证实其中含有目的基因。用抗Der p2单克隆抗体和制备的小鼠PEB1抗血清对rBCG进行间接免疫荧光鉴定。结果成功扩增了Derp2及PEB1基因,构建出重组质粒pCW-Der p2-PEB1,并将质粒电穿入BCG中,免疫荧光法鉴定其成功。说明成功地构建了胞壁表达Derp2-PEB1融合蛋白重组BCGpCW-Der p2-PEB1-rBCG。为基因工程疫苗的研制奠定了基础。

尘螨过敏原Der p 1、Der p 2特异性IgE化学发光免疫检测方法的建立及其性能评估

目的采用纳米磁微粒化学发光免疫技术建立尘螨过敏原第1、2组分(Der p 1、Der p 2)特异性免疫球蛋白E(sIgE)的定量检测方法。方法通过优化试剂组份和反应模式,评估纳米磁微粒化学发光免疫技术检测Der p 1、Der p 2 sIgE的各项性能指标。同时检测50例疑似尘螨过敏患者血清Der p 1、Der p 2 sIgE水平,与Phadia系统测定结果为标准进行比较,其一致性的比较采用Kappa检验。结果最佳实验体系为:磁微粒用量25μg,反应缓冲液(pH值7.4)含0.1 mol/L Tris-HCl、质量分数0.25%酪蛋白,包被液含20 mmol/L磷酸缓冲液(PB)、质量分数1%牛血清白蛋白(BSA),发光增强液含体积分数0.05%Triton X-100,采用两步法免疫反应,样本量为20μl,反应温度为37℃。检测体系最低检出限小于0.01 kU/L,线性范围0.2~100.0 kU/L,批内、批间精密度分别小于5%、7%,Der p 1和Der p 2交叉污染率分别为0.19%、0.21%。与Phadia系统测定结果比较,Der p 1阳性、阴性符合率分别为78.0%(32/41)、9/9,一致性较好(Kappa=0.65,P=0.008);Der p 2阳性、阴性符合率分别为93.3%(28/30)、85.0%(17/20),一致性也较好(Kappa=0.79,P=0.003)。结论成功建立了尘螨过敏原Der p 1、Der p 2 sIgE纳米磁微粒化学发光免疫检测方法,其各项性能指标良好,与Phadia系统有较好的一致性。

皮肤过敏面面观

容易引起面部皮肤过敏的因素 屋尘螨屋尘螨诱发的过敏是一个全球性问题，是引起过敏性疾病最重要的过敏原。屋尘螨主要寄生于卧室的床铺卧具、地毯、沙发、儿童毛绒玩具、宠物皮毛等容易积尘又不易清理打扫的地方。目前已从尘螨浸液中提纯3组纯化抗原，并制成了具有国际标准的高质量尘螨脱敏疫苗，在对尘螨过敏防治中取得了较好疗效。

为什么她们对性生活过敏?

笔者曾见一位数月未过性生活,性欲开始衰退的女性。她到医院就诊时说,每当她和丈夫在卧室中相爱时,她就发生哮喘,因而产生恐惧心理,不敢过性生活。医生分析了病情后,建议她试试换个地方作爱。她遵照医嘱,便没有发生哮喘。虽然,这个过敏反应病例的病因来源于性生活的环境,也就是说,引起哮喘的变态反应原存在于床垫和被褥中,如屋尘和尘螨。

胞壁型rBCG经口服免疫可以诱导BALB／c小鼠产生抗原特异性TH1应答

目的 观察胞壁型重组BCG（rBCG）经口服接种后对BALB／c小鼠TH细胞免疫应答的影响。方法 以100ml／L甘油为对照，分别将BCG和以膜蛋白形式表达屋尘螨抗原Derp2的rBCG经口服接种于8周龄BALB／c小鼠，109CFU／d，连续5d，用夹心EIASA测定小鼠血清、脾脏T淋巴细胞培养上清（SCS）和肠道相关淋巴细胞培养上清（GGS）中IL-4、IFN-γ水平，用双色荧光标记-流式细胞术测定脾脏淋巴细胞（SLC）和肠道相关淋巴细胞（GLC）中TH细胞亚群。结果免疫4周后，ELISA结果表明：BCG和rBCG两组血清和SCS的IFN-γ水平较对照组升高，IL-4水平降低；但两组小鼠GCS仅见IFN-γ水平升高。流式细胞测定结果表明：在CD4^＋的SLC中，BCG和rBCG免疫小鼠的IDl2R黠细胞比例升高，而CD30^＋细胞比例降低；在CD4^＋的GLC中，BCG和rBCG免疫小鼠的IFN-γ^＋细胞比例升高；至免疫后8周，上述改变进一步明显，但BCG和rBCG两组之间差异无统计学意义。体外给予抗原刺激后，rBCG组小鼠变化更加显著，而BCG组则无明显改变。但GCS的IL-4水平始终无法测得；同时GLC中IL-5^＋细胞比例仍持续较低。结论无论rBCG还是BCG通过口服免疫，均可诱导BALB／c小鼠产生TH1优势免疫应答；而胞壁型Derp2-rBCG诱导产生的TH1优势应答具有Der p2抗原特异（记忆）性。

HLA-DQ等位基因与哮喘相关性研究

目的 探讨在中国汉族哮喘家系中 ,HLA DQ基因与哮喘的相关性。方法 对 98例哮喘家系成员 ,用PCR 序列特异性引物 (PCR SSP)技术对HLA DQA1和B1进行基因分型 ,并与正常对照进行比较。结果 发现DQA1 0 10 1和DQA1 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组 (4 0 0 % ,45 0 % )较正常对照组 (16 4% ,13 4% )显著升高 (χ2 =6 186 0 ,P <0 0 5 ,RR =3 39;χ2 =11 6 0 90 ,P <0 0 1,RR =5 2 7) ;DQB1 0 30 3和DQB1 0 6 0 1等位基因频率在哮喘患者组 (5 5 0 % ,47 5 % )较正常对照组 (13 7% ,13 7% )显著升高 (χ2 =15 740 0 ,P <0 0 1,RR =7 6 8;χ2 =10 930 0 ,P <0 0 1,RR =5 6 9)。同时发现HLA DQB1 0 2 0 1等位基因频率在对屋尘螨抗原特异性IgE反应哮喘家系成员 (39 4% )较家系中非特应症者 (12 0 % )显著高频表达 (t =2 382 5 ,P <0 0 5 )。结论 HLA DQA1 0 10 1, 0 6 0 1和DQB1 0 30 3, 0 6 0 1是哮喘遗传易感等位基因 ;HLA DQB1 0 2 0