山冈单胞菌ZL261几丁质酶基因的克隆及原核表达

分离自西藏色季拉山海拔4 530 m高山草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas pratensis)ZL261具有很高的几丁质酶活性,为了明确其几丁质酶种类及作用特点,依据已报道的食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)Ter331胞外内切几丁质酶基因chiI相关序列设计引物,利用分段扩增的方法得到了菌株ZL261几丁质酶基因,并对其序列和编码蛋白的氨基酸进行分析。结果表明,全长1 338 bp的chiIQ基因编码的几丁质酶ChiIQ由445个氨基酸组成,分子量为46.04 kDa,等电点为5.67。序列比对和同源性分析发现,该基因与食真菌山冈单胞菌Ter331几丁质酶基因chiI序列相似性最高(92%),其氨基酸序列含有几丁质酶GH18家族高度保守序列SXGG和GXDXDXE,因此,ChiIQ属GH18家族。利用双酶切法构建了ZL261几丁质酶基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。本试验结果为后期研究几丁质酶在山冈单胞菌生防应用中的功能以及生防菌ZL261的开发和应用奠定了基础。

Collimonas sp.ZL261蛋白酶基因的克隆、表达及其酶学特性

分离自西藏色季拉山海拔4530 m高山草甸土壤的山冈单胞菌(Collimonas sp.)ZL261代谢产物具有很高的蛋白酶活性,为了明确其蛋白酶种类及其作用特点,本文采用限制性内切酶法构建了菌株ZL261的基因组文库,利用透明圈法筛选其胞外蛋白酶活性克隆,对其基因及蛋白结构进行了分析,进一步研究了该酶的表达和酶学特性。结果表明:该蛋白酶基因(命名为capro)包含一个长为1092 bp的完整开放阅读框(GenBank:KF992845),其编码蛋白由363个氨基酸组成;序列比对和同源性分析结果显示,该氨基酸序列与食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans)Ter331胞外蛋白酶序列(NC015856)相似性最高,为83%;一级、二级和三级结构分析均显示该蛋白含M35金属蛋白酶家族(EC 3.4.24.20)保守结构域。蛋白酶基因在大肠杆菌DH5α中异源表达获得了约38 kDa的目的蛋白。ZL261粗酶液对金属蛋白酶抑制剂EDTA敏感,最适作用pH值为7,最适温度30℃,在10℃时仍保持70%以上酶活力。综合分析可知,该蛋白酶为中性低温金属蛋白酶。具有较好的开发应用潜能。研究结果为微生物蛋白酶的开发提供了新型种质资源,也为探求不同生境微生物蛋白酶的系统进化关系提供了基础信息。