8-O-乙酰山栀子苷甲酸通过抑制脊髓背角JNK的磷酸化水平改善大鼠炎性痛的研究

目的:探究8-O-乙酰山栀子苷甲酸(8-O-acetyl-SM,8-Oa S)对于慢性炎性痛模型大鼠痛行为及脊髓背角星形胶质细胞内c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化水平的影响。方法:运用大鼠足底注射完全弗式佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)的方法建立慢性炎性痛模型;通过腹膜腔注射8-Oa S进行干预;采用von Frey丝测定大鼠足底50%机械性缩足反射阈值;应用免疫荧光组织化学染色法观察大鼠腰膨大节段脊髓背角胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及磷酸化的JNK(phosphorylatedc-Jun N-terminal kinase,p JNK)表达;应用Western Blot方法对大鼠脊髓背角内GFAP、JNK以及p-JNK的表达水平进行定量分析。结果:(1)行为学结果显示:与对照组相比,CFA模型大鼠机械性痛阈明显降低(P<0.01),腹膜腔注射8-Oa S可有效提高CFA诱导的机械性痛阈值(P<0.05);(2)免疫荧光染色结果显示:CFA模型脊髓背角内GFAP的表达量明显高于正常组,且p JNK基本表达于星形胶质细胞内;(3)Western Blot结果显示:与对照组相比,CFA造模后7 d脊髓背角内GFAP和p JNK表达明显上调,腹膜腔给予8-Oa S可以显著下调CFA诱导的脊髓背角内GFAP和p JNK的水平(P<0.01)。结论:腹膜腔内给予8-Oa S可有效提高炎性痛大鼠的机械性痛阈,其机制是通过下调脊髓背角星形胶质细胞内JNK信号通路的磷酸化水平进而抑制星形胶质细胞的激活。

用RP-HPLC法测定不同产地独一味药材中山栀子苷甲酯的含量

目的:建立测定不同产地独一味药材中山栀子苷甲酯含量的RP-HPLC方法。方法:采用SymmetryC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相:甲醇-水(25:75),流速:1.0ml/min,检测波长:238nm。结果:山栀子苷甲酯在5.0～50μg/ml(r=0.9998)线性关系良好,加样回收率为94.7%,RSD为2.8%。9批不同产地独一味药材中山栀子苷甲酯的含量为0.12%～1.30%,甘肃玛曲县所产独一味的除根以外的部分的山栀子苷甲酯的含量最高(1.30%)。结论:本方法准确、可靠,适于独一味药材中山栀子苷甲酯含量的测定。不同产地独一味药材中山栀子苷甲酯含量存在较大差异。

HPLC测定藏药螃蟹甲中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量

目的建立藏药螃蟹甲中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的HPLC测定方法,为进一步控制螃蟹甲药材及其制剂的质量提供参考依据。方法色谱柱为Symmetry C18(4.6mm×150mm,5μm),流动相:乙腈-水(6∶94),HAc调pH=4.50,流速0.8mL/min,柱温20℃,检测波长234nm。结果8-乙酰氧基山栀子苷甲酯浓度在0.787～14.76μg·mL-1范围内与峰面积积分值线性关系良好(r=0.9999);加样回收率为99.21%(RSD=1.68%)。螃蟹甲药材中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯平均含量为(0.62±0.19)mg.g-1。结论本方法简便、准确、专属性强,可用于螃蟹甲药材中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量测定。

基于p38 MAPK-CRYAB途径探讨8-O-乙酰山栀子苷甲酸对急性心肌梗死大鼠的影响及作用机制

目的基于p38MAPK-CRYAB途径探讨8-O-乙酰山栀子苷甲酸对急性心肌梗死大鼠的影响及作用机制。方法采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌梗死大鼠模型,取50只造模成功的雄性SD大鼠随机分为模型组、阳性对照组、8-O-乙酰山栀子苷甲酸低、中、高剂量组,每组10只,另选10只作为空白对照组。空白对照组与模型组均给予等体积生理盐水,阳性对照组给予阿司匹林肠溶片100mg/(kg·d),8-O-乙酰山栀子苷甲酸低、中、高剂量组分别给予8-O-乙酰山栀子苷甲酸10、20及30mg/(kg·d),连续给药14天。检测大鼠心功能;HE染色法观察大鼠心肌组织病理变化;TUNEL法检测心肌细胞凋亡;ELISA检测SOD、LDH、GSH-Px和MDA水平;RT-PCR检测Bcl-2、Bax和Caspase-3mRNA表达;Western blot检测p-p38MAPK/p38MAPK和p-CRYAB/CRYAB表达。结果8-O-乙酰山栀子苷甲酸可显著改善急性心肌梗死大鼠的心功能及心肌组织病理变化(P<0.05),降低心肌细胞凋亡率(P<0.05),减轻氧化应激损伤(P<0.05),上调抑凋亡基因Bcl-2表达,下调促凋亡基因Bax和Caspase-3表达(P<0.05),促进p38MAPK和CRYAB磷酸化(P<0.05),但各组间p38MAPK和CRYAB蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论8-O-乙酰山栀子苷甲酸可显著改善急性心肌梗死大鼠心肌损伤症状,上调Bcl-2表达,下调Bax和Caspase-3表达,促进p38MAPK和CRYAB磷酸化,其作用机制可能与p38MAPK-CRYAB途径有关。

8-O-乙酰山栀子苷甲酸对慢性炎性痛模型大鼠的镇痛作用机制研究

目的:研究8-O-乙酰山栀子苷甲酸(8-OaS)对慢性炎性痛模型大鼠的镇痛作用机制。方法:将30只雄性SD大鼠分为假手术组(生理盐水)、模型组(生理盐水)和8-OaS低、中、高剂量组(3、10、30μg/kg),每组6只。除假手术组外,其余各组大鼠足底注射弗氏完全佐剂复制慢性炎性痛模型。造模成功后,各组大鼠鞘内给予相应药物,每天1次,连续给药7 d后,采用Von-Frey细丝检测各组大鼠足底疼痛阈值,计算各组大鼠疼痛阈值曲线下面积和8-OaS的半数有效剂量(ED50)。另取36只雄性SD大鼠分为假手术组(生理盐水)、模型组(生理盐水)和8-OaS组(给药剂量为ED50),同法造模及给药,然后采用免疫荧光组织染色法观察各组大鼠脊髓背角内离子钙结合衔接分子1(Iba-1)、磷酸化p38丝裂原激活的蛋白激酶(p-p38 MAPK)的阳性表达情况,采用Western blotting法检测各组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6及肿瘤坏死因子α(TNF-α)的蛋白表达水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠足底疼痛阈值和曲线下面积均显著降低(P<0.01);与模型组比较,8-OaS低剂量组大鼠给药5、6、7 d后足底疼痛阈值显著升高(P<0.05),8-OaS中、高剂量组大鼠足底疼痛阈值和曲线下面积均显著升高(P<0.05或P<0.01);8-OaS各剂量组上述指标大部分有显著差异(P<0.05或P<0.01);8-OaS的ED50为18.87μg/kg。免疫荧光组织染色和Western blotting法结果显示,p-p38 MAPK主要表达在Iba-1阳性表达的细胞上;与假手术组比较,模型组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38MAPK的荧光密度和Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,8-OaS组大鼠脊髓背角内Iba-1、p-p38 MAPK的荧光密度和Iba-1、p-p38 MAPK、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论:鞘内给予8-OaS可有效缓解大鼠慢性炎性痛,其机制可能与抑制p38 MAPK的磷酸化和IL-6、IL-1β、TNF-α的表达有关。

8-O-乙酰山栀子苷甲酸对慢性炎性痛模型大鼠脊髓背角内HDAC1～5表达的影响及与JAK_2-STAT_3信号通路的关系研究

目的:研究8-O-乙酰山栀子苷甲酸(8-OaS)对慢性炎性痛模型大鼠脊髓背角内组蛋白去乙酰化酶1～5(HDAC1～5)表达的影响及与Janus激酶2-信号转导与转录活化因子3(JAK_2-STAT3)信号通路的关系。方法:取SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组(生理盐水)、完全弗氏佐剂(CFA)组(生理盐水)和8-OaS低、中、高剂量组(2、20、200μg/kg),每组6只,除正常对照组和假手术组外,其余各组大鼠左侧后足趾侧皮下注射CFA复制慢性炎性痛模型,建模后腹腔注射相应药物,每日1次,连续7 d。采用热辐射法检测首次给药第1、2、3、4、5、6、7、8、11、15天大鼠的缩足潜伏期。另取大鼠按上述后5组方法进行分组给药,采用Western blot法检测大鼠末次给药后腰膨大节段脊髓背角中HDAC1～5、磷酸化JAK_2(pJAK_2)、磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白表达情况。再另取大鼠随机分为假手术组(生理盐水)、CFA组(生理盐水)、8-OaS组(20μg/kg)和JAK_2-STAT_3的拮抗药α-氰基-(3,4-羟基)-N-苄苯乙烯胺(AG490)组(8 mg/kg),每组6只,同上法复制IP模型后腹腔注射相应药物,每日1次,连续7 d,采用免疫荧光组织化学染色观察各组大鼠HDAC5和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在脊髓背角的表达情况。结果:与正常对照组和假手术组比较,其余各组大鼠的缩足潜伏期均明显缩短(P<0.05);与CFA组比较,8-OaS低、中、高剂量组大鼠的缩足潜伏期均明显延长(P<0.05),且呈剂量依赖性。与假手术组比较,CFA组大鼠脊髓背角中HDAC1～5、pJAK_2、pSTAT3蛋白表达均明显增强(P<0.05);与CFA组比较,8-OaS低、中、高剂量组大鼠脊髓背角中HDAC5、pJAK_2、pSTAT3蛋白表达均明显降低(P<0.05),但HDAC1～4蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。HDAC5大量表达于星形胶质细胞上,与假手术组比较,CFA组大鼠脊髓背角中GFAP和HDAC5表达均明显增强(P<0.05);与CFA组比较,8-OaS组和AG490组大鼠脊髓背角中GFAP和HDAC5表达均明显降低(P<0.05)。结论:8-OaS可有效缓解由CFA诱导的慢性炎性痛,其机制可能与下调脊髓背角中HDAC5表达和JAK_2、STAT3的磷酸化水平有关。

基于UHPLC-Q-TOF-MS技术分析栀子花的化学成分

目的:采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用技术(UHPLC-Q-TOF-MS)对栀子花的化学成分进行快速分析。方法:采用UHPLC-Q-TOF-MS联用仪,以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱,流速为0.3 mL/min。采用ESI正离子模式采集检测,以PeakView质谱分析软件分析数据。结果:根据质谱所提供的保留时间、精确相对分子量及二级质谱裂解碎片信息并结合相关参考文献进行分析,从栀子花中共检测到31个化合物,主要包括环烯醚萜类、三萜类和黄酮类化学成分。结论:UHPLC-Q-TOF-MS能快速、灵敏、精确地对栀子花的化学成分定性分析,为探讨栀子花的药效物质基础提供了依据。

HPLC法测定藏药独一味中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量

目的:建立以高效液相色谱法测定藏药独一味中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯含量的方法。方法:色谱柱为Symmetry C18(150mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-水(15∶85),检测波长为234nm。结果:8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的检测浓度在1.97～19.68μg.mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r=0.999 6);平均回收率为99.53%,RSD=1.73%(n=9)。结论:本方法简便、准确、专属性强,可为独一味药材品质评价及开发利用提供参考。

独一味制剂中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量测定

目的：建立藏药独一味制剂中8－乙酰氧基山栀子苷甲酯的高效液相色谱测定方法，为进一步控制独一味制剂的质量提供良好的参考。方法：色谱柱为Symmetry C18（4．6mm×150mm，5μm），流动相乙腈-水（15：85），流速1．0mL·min^-1，柱温20℃，检测波长234nm。结果：8-乙酰氧基山栀子苷甲酯在1．2～20．0mg·L^-1范围内与峰面积积分值线性关系良好（r=0．9999）；加样回收率为99．55％（RSD为1．77％）。所有制剂均检测出8-乙酰氧基山栀子苷甲酯，但含量差别较大。结论：本方法简便、准确、专属性强，测定独一味制剂中8乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量是十分有必要的。

接骨木根皮的化学成分研究

目的:研究接骨木根皮(roots of Sambucus williamsii Hance)的化学成分。方法:采用反复的柱色谱和HPLC等分离手段,对接骨木根皮乙醇提取物进行分离,并通过核磁共振谱和质谱等波谱数据对其结构进行鉴定。结果与结论:从接骨木根皮中分离得到6个化合物,分别鉴定为α-莫诺苷(α-morroniside,1),β-莫诺苷(β-morroniside,2),山栀子苷A(Caryoptoside,3),(7S,8R)-4,9,9'-三羟基-3,3'-二甲氧基-7,8-二氢苯骈呋喃-1'-丙醇基新木脂素((7S,8R)-4,9,9'-trihydroxy-3,3'-dimethoxy-7,8-dihydrobenzofuran-1'-propanolneolignan,4),Ligstroside(5),β-谷甾醇(6)。

长舟马先蒿化学成分研究

为了进一步研究玄参科长舟马先蒿的化学成分,我们从其全草的乙醇提取物中分离得到1个新环烯醚萜苷和12个已知化合物。根据波谱数据(1D,2D-NMR,HSQC,HMBC,ROESY,MS)分别鉴定为gardoside methylester(1)、7-O-acetylgardoside methyl ester(2)、verbascoside(3)、leucosceptoside A(4)、jionoside D(5)、martynoside(6)、2″-O-acetylmartynoside(7)、uridine(8)、adenosine(9)、benzyl alcohol-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-gluco-pyranoside(10)、2-phenylethyl O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside(11)、apigenin(12)、lariciresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside(13),其中7-O-acetylgardoside methyl ester(2)为一个新化合物。

栀子中4种环烯醚萜苷类成分治疗大鼠血管性痴呆的药效学研究

目的:比较栀子中4种环烯醚萜类成分抗血管性痴呆的活性。方法:血管性痴呆模型大鼠术后3 d经口给予京尼平苷、京尼平苷酸、山栀子苷甲酯及京尼平溶液,剂量为15 mg·kg-1,连续给药30 d,进行空间探索和定位航行实验等行为学测试和大脑病理切片观察。结果:空间探索和定位航行实验结果显示,京尼平苷、京尼平苷酸、京尼平能改善模型大鼠的学习能力和记忆能力(P<0.05或0.01);脑组织病理切片显示,京尼平苷、京尼平苷酸和京尼平组大鼠海马CA1区和大脑皮质内锥体层各脑区的神经元变性情况明显优于模型组大鼠。结论:京尼平、京尼平苷酸和京尼平苷可能具有抗血管性痴呆的作用,山栀子苷甲酯没有抗血管性痴呆的作用。

独一味与糙苏中环烯醚萜苷类成分的比较

目的比较独一味与糙苏中的环烯醚萜苷类成分。方法采用TLC法鉴别独一味与糙苏药材中的环烯醚萜苷类成分,建立HPLC法测定其中的8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量。结果糙苏及独一味均含有大量的环烯醚萜苷类成分,两者根部具有十分相似的薄层色谱图、地上部分及根部中8-乙酰氧基山栀子苷甲酯的含量分别为17.41、0.5、6.81、8.50 mg.g-1。结论独一味根与糙苏根中含有相近的环烯醚萜苷类成分。

藏药独一味中的主要化学成分环烯醚萜苷化合物在动物的镇痛抗炎作用研究

目的比较独一味中环烯醚萜苷化合物在小鼠体内的镇痛与抗炎活性。方法 5种环烯醚萜苷化合物:8-乙酰氧基山栀子苷甲酯(Ⅰ)、8-去羟基山栀子苷(Ⅱ)、sesamoside(Ⅲ)、7,8-dehydro-penstemoside(Ⅳ)、山栀子苷甲酯(Ⅴ),均在小鼠尾静脉一次注射给药200 mg·kg-1,阳性对照组给予吗啡5 mg·kg-1,空白对照组给予0.9%氯化钠。用经典的动物实验模型,评价其体内镇痛、抗炎作用。结果给药后5种单体化合物均显示了一定的镇痛抗炎活性,其中Ⅰ和Ⅱ都能显著减少小鼠扭体次数,抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀,抑制足部注射福尔马林所致第二阶段疼痛反应,抑制角叉菜胶诱导小鼠足肿胀,降低醋酸诱导的腹腔通透性的增加,减少腹腔内伊文思蓝含量和腹腔白细胞游走。但不能延长小鼠热板痛阈值,不能减少福尔马林致疼痛第一阶段舔足次数。结论藏药独一味中的5种环烯醚萜苷单体,尤其是8-乙酰氧基山栀子苷甲酯和8-去羟基山栀子苷具有较好的体内镇痛、抗炎作用。

指纹图谱结合一测多评法的栀子质量控制方法研究

目的建立栀子的指纹图谱,并同时建立其中6个主要成分含量的一测多评分析方法,以期对栀子药材进行整体质量控制。方法基于高效液相色谱结合紫外变波长分段检测,在各类化合物的最大吸收波长下,建立包含环烯醚萜苷类(240 nm)及二萜类(440 nm)成分信息的栀子指纹图谱。在此基础上,分别以栀子苷和西红花苷Ⅰ为内标,计算4个环烯醚萜苷类成分(山栀苷、山栀子苷B、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷)和2个二萜类成分(西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ)的校正因子,通过4台高效液相色谱仪及4根不同色谱柱进行耐用性考察,并与外标法测定结果比较,验证一测多评方法的准确性。结果19批栀子的指纹图谱共标定20个共有峰,相似度为0.981~0.999;在240 nm下,以栀子苷为内标,山栀苷、山栀苷B、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的校正因子分别为1.15、1.36、1.54和1.00;440 nm下,以西红花苷Ⅰ为内标,西红花苷Ⅱ的相对校正因子为1.11,且耐用性较好。应用一测多评法测定6个成分的含量,与外标法测定结果比较,含量准确度均值为100.14%,RSD<3%,无明显差异。19批栀子中6个待测成分的质量分数范围分别为0.09%~0.35%、0.28%~0.82%、0.31%~1.00%、4.60%~7.78%、0.62%~1.64%和0.07%~0.26%。结论所建立的指纹图谱结合一测多评法简便可行,可为栀子药材整体质量控制提供一定参考和依据。

基于谱效关系的独一味抗小鼠耳肿胀作用的药效物质基础研究

目的:基于谱效关系研究并经实验验证,阐明独一味抗炎药效物质基础。方法:对12批不同来源的独一味进行HPLC分析,建立指纹图谱。基于小鼠耳肿胀模型,测定各批次独一味水提物的耳肿胀率及其抑制率、血清中TNF-α、IL-6的含量。运用灰色关联度法及文献对比,分析独一味水提物中与抗炎药效关联较强的成分,验证其在独一味水提物抗炎药效中的贡献度。结果:建立了独一味水提物HPLC指纹图谱,共标定了16个共有峰,通过对照品指认,辨识了山栀子苷甲酯、8-O-乙酰山栀子苷甲酯、连翘酯苷B和木犀草苷等7个特征峰成分,除胡麻属苷、芦丁含量较低外,其余5种成分均有较高含量。二甲苯致耳肿胀试验结果表明,12批独一味水提物均有抑制耳肿胀作用。通过灰色关联度法和文献对比研究分析,推测山栀子苷甲酯、8-O-乙酰山栀子苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷与独一味水提物抗炎作用密切相关,对此4种成分进行含量测定,含量测定结果依次为(15.319±4.228)、(26.156±7.174)、(14.376±5.817)、(12.756±2.570)mg/g。以对照品模拟活性成分配比构建药效对比验证实验确认了这一推测。结论:山栀子苷甲酯、8-O-乙酰山栀子苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷可能为独一味水提物抗炎药效的关键成分群。