基于蛋白质组学探讨羟基-α-山椒素对糖尿病心肌病的作用机制

目的基于蛋白质组学检测技术,探讨羟基-α-山椒素(hydroxy-α-sanshool,SAN)治疗糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的作用机制。方法高脂饲料喂养及腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)联合使用建立DCM模型。分为对照组(CON组)、DCM组和SAN治疗组(DCM+SAN组)。小动物心脏超声及病理染色评价小鼠心脏功能及组织形态,蛋白组学技术推测SAN对DCM的作用机制,Western blot实验验证cAMP/PKA信号通路关键蛋白表达水平。结果心脏超声与病理染色显示SAN对DCM小鼠心脏有保护作用。DCM+SAN组与DCM组进行蛋白组学检测,共鉴定160个差异蛋白,127个蛋白表达上调,33个蛋白表达下调;GO二级功能注释显示细胞过程、分子结构和细胞结构等功能;KEGG富集分析显示cAMP信号通路富集最为丰富;蛋白互作网络显示以PKA为中心节点与多种蛋白在cAMP信号通路中有互作关系。Western blot验证DCM组的cAMP和PKA蛋白相对表达量均明显低于CON组(P<0.05);DCM+SAN组的cAMP和PKA蛋白相对表达量均明显高于DCM组(P<0.05)。结论SAN对糖尿病心功能有保护作用,通过cAMP信号通路发挥作用。

羟基-α-山椒素与肌原纤维蛋白互作及其麻味感知机制

花椒中的酰胺类物质羟基-α-山椒素(α-SOH)与蛋白质的相互作用可增强川菜中肉类菜肴的麻味。为明晰肉类加工中二者的结构变化及附着情况,探究热诱导(60,70,90℃)的猪肉肌原纤维蛋白(MPs)与α-SOH的互作机制,并通过分子对接解析α-SOH的麻味激活机制。结果表明,α-SOH可增加α-SOH/MPs复合物的表面疏水性,促进热处理MPs的解聚。α-SOH酰胺基团中的N-H键易与氨基酸残基之间形成稳定氢键,改变蛋白的亚基聚集状态,从而显著减弱SDS-PAGE上大于45 ku的条带。荧光图谱和圆二色谱结果证实α-SOH导致蛋白二级结构由规则向无序状态转变。适度热处理(60℃和70℃)的MPs更易与α-SOH形成复合物,从而降低游离α-SOH含量。分子对接结果显示,α-SOH激活麻味是通过与TRPV1受体上的L681结合产生。本试验阐明MPs与α-SOH的互作机制以及激活麻味的机理,可为肉制品加工中的麻味调控提供理论依据。

液相色谱-串联质谱法测定花椒中的6种山椒素及其产地鉴别

目的 建立液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)快速测定花椒中6种山椒素的方法 ,并进行产地分析。方法 样品通过甲醇超声提取,LC-MS/MS外标法测定,对提取方式、仪器条件进行了优化,与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测进行比较,对方法 正确度、精密度、检出限和定量限进行了验证。利用该方法 对不同产地的10个青花椒、33个红花椒进行测定,通过聚类分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)进行产地分析鉴别。结果 6种山椒素在LC-MS/MS上分离良好,在0.10~5.00μg/m L范围内线性关系良好,相关系数(r^(2))≥0.996,检出限为0.10×10^(–3)~0.18×10^(–3) mg/g,定量限为0.33×10^(–3)~0.61×10^(–3) mg/g;在低、中、高3个水平下6种山椒素的平均回收率在86.67%~100.67%之间,相对标准偏差为0.72%~9.11%,正确度和精密度均符合方法 验证要求,检出限、定量限均低于HPLC方法 ,灵敏度、准确度更高。通过对不同产地花椒的检测结果 显示,羟基-α-山椒素为含量最高的麻味物质,且两类花椒测定结果 均表现出汉源花椒中6种山椒素总量高于其他产地花椒的特点。通过聚类分析、PCA分析表明,汉源青花椒中羟基-β-山椒素,红花椒中羟基-α-山椒素、羟基-γ-山椒素、γ-山椒素含量均高于所测其他产地同种花椒中麻味物质含量,是区别于其他产地花椒的主要麻味物质。结论 该方法 前处理简单,灵敏度、准确度高,可用于花椒中6种山椒素的检测,且通过对花椒中6种山椒素的检测及聚类、PCA分析能有效区分汉源花椒与其他产地花椒,为鉴别真假汉源花椒提供了可靠的方法 。

HPLC-MS/MS测定花椒及其制品中羟基-α-山椒素

建立了液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定花椒及其制品中羟基-α-山椒素的分析方法。样品经70%甲醇水溶液超声提取2次,每次10 min,以0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相梯度洗脱,经C18色谱柱分离,正离子模式扫描,多重反应监测模式检测。以保留时间和特征离子对(母离子和两个碎片离子)信息比较进行定性,外标法定量。结果表明:在2~500 ng/mL范围内,羟基-α-山椒素的线性回归方程相关系数为0.999;样品添加不同浓度梯度的标准溶液,平均回收率在80.8%~94.4%,相对标准偏差(RSD)在0.8%~4.9%。当样品称取为1 g,定容体积为25 mL时,检出限(LOD)为0.05 mg/kg,定量限(LOQ)为0.1 mg/kg。该方法高效快捷、准确度和精密度满足检测要求,能准确测定羟基-α-山椒素的含量,可为花椒及其制品的质量控制提供参考依据。

RP-HPLC法同时测定花椒提取物中3种山椒素的含量

目的建立同时测定花椒提取物中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素含量的RP-HPLC色谱法。方法采用PhenomenexSynergi C18色谱柱（250mm×4．6mm ，4μm）；流动相为乙腈（A）-水（B）；流速为1．0mL·min^-1；梯度洗脱：0-15min，φ（乙腈）=40％-50％，15-25min，φ（乙腈）=50％～60％；检测波长为270nm；柱温为30℃。结果羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素分别在6．48-58．32、1．31-11．81和0．61-5．48mg·L。内线性关系良好。平均加样回收率分别为97．5％、97．4％和97．0％，RSD分别为1．5％、1．6％和1．4％（n=6）。该方法应用于花椒提取物的含量测定，测得3批自制花椒提取物中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的含量分别为41．2％-46．9％、8．17％～9．28％和4．47％-5．11％。结论该方法可为花椒提取物的质量控制提供参考依据。

高效液相色谱法测定贵州顶坛花椒中麻味成分羟基-β-山椒素的含量

为了对贵州顶坛花椒中的麻味成分进行定量测定，从贵州产顶坛花椒中分离得到麻味特征性成分羟基-β-山椒素，并建立高效液相色谱方法定量检测花椒中羟基-β-山素椒的含量。色谱柱：YMC-Pack ODS-A（6．0 mm×150 mm，5μm）；流动相：乙腈∶水（V／V 为45∶55）；流速为0．7 mL／min，柱温为35℃，波长为254 nm；线性范围为0．01～0．14μg，相关系数R2＝0．9994，检测限为0．0002μg，回收率在97．92％～103．60％，相对标准偏差（RSD）＜2．0％。结果表明：贵州顶坛花椒中羟基-β-山椒素的含量较高，符合其“麻味重”的特点。

RP-HPLC法同时测定武都花椒中3种山椒素

以武都花椒为样品,采用有机溶剂浸提法提取试验样液,建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时测定花椒中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素含量的方法.用迪马Silversil-C18色谱柱,以甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(68∶30∶2,V/V/V)进行等度洗脱,检测波长270 nm,流速1 mL·min^(-1),进样量20μL,柱温30℃.结果表明,羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素在各自质量浓度范围内线性关系良好(r≥0.9998),其检测限分别为0.059,0.092和0.037μg·mL^(-1),定量限分别为3.91,6.16和2.45 ng,且检测方法的精密度、重复性、稳定性以及准确性良好.使用该方法测得12批次供试品中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素的含量分别为71.75~191.65,8.32~22.93和2.45~4.05 mg·g^(-1),相对标准偏差分别为1.23%~3.99%,3.11%~4.98%和0.94%~3.54%.该方法适用于花椒中山椒素含量的测定,其结果可为武都花椒的质量评价与应用提供参考依据.

山椒素药理学研究进展

中药花椒为芸香科花椒属植物的果皮,具有止痒、止痛、杀虫等功效。近年来研究发现,山椒素作为花椒中主要的生物活性成分,能够与多种离子通道和受体结合,发挥广泛的生物学效应,起到麻醉镇痛、肠道保护、降血糖等作用。该文主要从药代动力学、药物靶点及药理作用三方面进行综述,以期为山椒素的系统研究及新药开发提供参考。

响应面优化微波辅助提取花椒叶山椒素及其生物活性研究

以花椒叶为原料,乙醇作为溶媒,研究花椒叶山椒素微波辅助提取工艺条件,采用响应面法对工艺进行优化。以清除铁还原力、羟基自由基(·OH)能力及2,2′-联氨-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)能力来评价体外抗氧化能力和α-淀粉酶活性抑制率来评价其降血糖能力。结果表明,花椒叶山椒素最佳提取工艺条件为微波温度25℃、微波时间10 min、微波功率400 W、料液比1∶20(g/mL)、乙醇浓度58%、在此条件下花椒叶山椒素最高提取率为5.98 mg/g。花椒叶山椒素具有较强的抗氧化活性和降血糖能力,铁还原力、清除·OH自由基能力、清除ABTS自由基能力和α-淀粉酶抑制率均表现出一定的质量浓度依赖性;花椒叶山椒素铁还原力、清除·OH、清除ABTS自由基能力和α-淀粉酶抑制率半数有效质量浓度(IC_(50))分别为56.09、37.67、34.49和7.93μg/mL。花椒叶山椒素可以作为一种天然食源性抗氧化和降血糖剂。

花椒提取物羟基-α-山椒素通过调节Nrf2/HO-1通路减轻心肌损伤

目的:研究花椒提取物羟基-α-山椒素对异丙肾上腺素所致心肌缺血大鼠和过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)氧化损伤的保护作用及可能机制。方法:36只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、盐酸地尔硫卓20 mg/kg、羟基-α-山椒素5、10和20 mg/kg组。各组大鼠连续给药14 d,在13、14 d腹腔注射异丙肾上腺素(ISO)40 mg/kg造成心肌缺血模型,超声心动图检查评估各组大鼠心功能;试剂盒检测血清丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6含量;实时荧光定量qRT-PCR法检测心肌组织Tnfa、Il1和Il6 mRNA表达;苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察心肌组织病理改变。体外培养H9c2细胞,用H2O2600μmol/L处理H9c2细胞6 h构建氧化损伤体外细胞模型,随机分为正常对照组、模型对照组、羟基-α-山椒素2.5、5、10μg/mL组。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法筛选羟基-α-山椒素最佳给药浓度;采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观测细胞凋亡情况;流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)浓度;ELISA法检测MDA、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和SOD含量或活力;蛋白质印迹法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(BAX)、血红素氧合酶1(HO-1)、切割胱天蛋白酶3(Cleaved-caspase 3)和B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)蛋白表达水平。结果:与正常对照组相比,模型对照组大鼠左心室短轴缩短率(LVFS)和射血分数(LVEF)显著降低(P<0.01),血清MDA、cTnl、LDH、CK-MB含量或活力显著升高(P<0.01),GSH、SOD活力显著降低(P<0.01),心肌组织中Il1b、Il6及TnfamRNA表达明显上调(P<0.05);与模型对照组相比,羟基-α-山椒素各剂量组LVFS和LVEF明显升高(P<0.05),羟基-α-山椒素20 mg/kg组MDA、cTnl、LDH、CK-MB含量或活力明显降低(P<0.05),GSH、SOD活力明显升高(P<0.05或P<0.01),心肌组织中Il1b、Il6及TnfamRNA表达明显下调(P<0.05),羟基-α-山椒素各剂量组心肌组织损伤减轻,心肌细胞胶原沉积减少。与正常对照组比较,H2O2模型对照组H9c2细胞活力、线粒体膜电位降低,细胞凋亡率、ROS水平、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高,GSH-Px、SOD活力降低(P<0.01),经羟基-α-山椒素预处理后,H9c2细胞活力显著升高、线粒体膜电位升高,羟基-α-山椒素5、10μg/mL组细胞凋亡率、ROS浓度、MDA、IL-1β、IL-6含量降低,GSH-Px、SOD活力显著升高(P<0.01),羟基-α-山椒素10μg/mL组细胞TNF-α含量显著降低(P<0.01),羟基-α-山椒素处理H9c2细胞后Nrf2(核内)、HO-1、BCL-2蛋白表达上调,Nrf2(核外)、BAX、Cleaved-caspase3蛋白表达下调(P<0.01)。结论:羟基-α-山椒素可改善ISO所致心肌缺血大鼠的心功能、心肌损伤及纤维化程度,保护H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤,改善H9c2细胞凋亡,其作用机制可能与抑制氧化应激反应和炎症因子释放,激活Nrf2/HO-1信号通路有关。

羟基γ-异山椒素抑制人体卵巢颗粒细胞雌激素生物合成的机制研究

目的:探讨羟基γ-异山椒素抑制人体卵巢颗粒细胞雌激素合成的相关机制。方法:利用CCK-8检测4种山椒素对人卵巢颗粒细胞系(KGN细胞株)增殖的影响;Elisa法检测4种山椒素对KGN细胞雌二醇合成的影响;RT-qPCR检测KGN细胞芳香化酶基因;Western blot法检测芳香化酶蛋白及相关通路蛋白。结果:羟基γ-异山椒素抑制雌二醇生物合成效果最佳[半抑制浓度(IC50)=(16.63±0.39)μmol·L^(-1)],并且在该浓度下对KGN细胞的增殖无明显抑制作用。在羟基γ-异山椒素干预后,芳香化酶基因和蛋白表达水平显著下降(P<0.05),且芳香化酶的活性未受到明显影响;同时,羟基γ-异山椒素能显著降低P-CERB,P-AKT,P-p38蛋白的表达(P<0.05)。结论:羟基γ-异山椒素可能通过抑制p38/MAPK和PI3K/AKT通路的激活,降低CREB的磷酸化,抑制芳香化酶转录,最终抑制KGN细胞雌激素生物合成。

藤椒中山椒素测定方法研讨及含量分析

目的:建立测定藤椒中山椒素的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法:采用乙腈提取剂,超声辅助提取2次,合并提取液,稀释定容后过滤测定。高效液相色谱测定酰胺类物质,色谱柱:XBridge C18 5μm 4.6 mm×250 mm,检测器:二极管阵列检测器(DAD)。利用建立的方法连续测定种植基地2018年不同采摘时节藤椒中羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素的含量。结果:回收率为90.8%~115.6%,相对标准偏差为0.02%~2.3%(n=6),在0.9261~491.4467μg/m L线性范围内方程相关系数达到0.9999。结论:该方法简便、快速、准确、灵敏,适用鲜藤椒中山椒素的测定,种植基地测得结果显示6月底鲜藤椒中山椒素含量最高,为当地藤椒采摘和产业发展提供了科学指导和理论基础。

花椒及花椒制品中羟基-α-山椒素检测方法

建立花椒及花椒制品中羟基-α-山椒素的紫外分光光度计(UV)测定方法。对羟基-α-山椒素的测定波长、提取试剂、提取试剂体积、提取时间、提取方式、对照品及样品溶液检测稳定性以及检测方法线性、精密度、回收率进行研究。确定提取试剂为乙醇,提取试剂体积100 mL,提取时间15 min,提取方式为超声,对照品及样品溶液在24 h内稳定,方法线性、精密度良好,平均回收率96.8%~97.8%。试验提供一种简便、快捷、稳定、可靠的测定花椒及花椒制品中羟基-α-山椒素的方法。

基于差分脉冲伏安法快速检测花椒油树脂中的麻味物质

麻味物质含量是花椒油树脂的重要品质指标,文章基于电化学原理中的差分脉冲伏安法首次建立了一种采用未修饰的丝网印刷电极测定花椒油树脂中麻味物质的快速检测方法,通过优化电化学工作站中的富集时间、电压以及待测液中的甲醇占比、pH值,并以紫外分光光度计检测法为对照构建出了该方法。结果表明,以未修饰的丝网印刷电极检测花椒油树脂中麻味物质的适宜条件:富集时间为120 s,富集电压为0.2 V,甲醇在待测液中占比小于5%,pH值为1,2,3,山椒素的电流值与其浓度在2~50 mg/L范围内呈良好的线性关系(R^(2)=0.999),加标回收率在97.60%~108.40%之间,检出限为0.22 mg/L。经验证,该方法与行业标准GH/T 1290—2020方法具有良好的检测一致性(RSD=4.75%),建立的快速检测方法既具有操作简单、方便快速的优点,又兼具传统方法的准确性与重复性,因此可以作为花椒及其制品中麻味物质的快速检测方法进行科学研究与企业生产实践,且有望基于该方法开发出便携式麻味物质快速检测仪器。

花椒水煮及热油处理麻味素的含量变化研究

采用高速逆流色谱从花椒萃取物中纯化花椒麻味素标准品。模拟厨房水煮、油煎条件,高效液相色谱外标法定量分析,研究了水煮、热油处理对花椒麻味素含量的影响。结果表明,热油处理时花椒麻味素的浸出量远高于水煮,但其热损失也大;随着水煮或热油处理的时间增长,萃取出的花椒麻味素量均呈现先增加后减小的趋势;油温升高,花椒麻味素损失显著增大,油温控制在<190℃较好。传统烹饪中,水煮1.5h较好,煮出的麻味物质含量高;热油处理时油温150 180℃时间0.5h较好,油液中麻味物质含量高。

超临界CO2分步萃取花椒香气和麻味物质的初步研究

采用超临界CO2萃取法分步提取九叶青花椒香气和麻味物质。以气相色谱-质谱联用仪对其化学成分进行检测,并用色谱峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量。结果表明,低压萃取的花椒提取物得率为5.0%,检测到50种化学成分及其相对含量,未检测出多烯酰胺类物质;高压萃取的花椒提取物得率为2.0%,检测到13种化学成分及其相对含量,呈麻味的多烯酰胺类物质含量较高。

超高效液相色谱-串联质谱法同时快速测定食用油中9种外源性杂质成分

建立了超高效液相色谱-串联质谱同时快速测定食用油中9种外源性杂质成分的分析方法。样品经乙腈涡旋提取后,采用XSelect~?HSS PFP(100 mm×2.1 mm,3.5μm)色谱柱,以5 mmol/L甲酸铵-乙腈为流动相进行梯度洗脱,在10 min内实现9种待测物的良好分离。在电喷雾正离子模式下,以多反应监测(MRM)模式采集数据并作定性鉴别和定量分析。结果表明,9种待测物在相应的质量浓度范围内线性关系良好,相关系数(r^2)均大于0.996;在3个不同浓度加标水平下,平均回收率为68.2%～104%,相对标准偏差(RSD)为2.2%～12%,检出限(LOD,S/N≥3)和定量下限(LOQ,S/N≥10)分别为0.02～0.10μg/kg及0.05～0.25μg/kg。结果表明,该法简单、快速、灵敏、准确、可靠,适用于食用油中9种难挥发外源性特征杂质的同时快速定性和定量分析。

超临界二氧化碳萃取技术在花椒麻味成分分离中的应用研究

在超临界 CO2 流体萃取花椒过程中 ,使用乙醇作为夹带剂 ,将花椒中的麻味成分如山椒素等萃取分离出来 ,探讨了萃取压力、温度以及夹带剂纯度等因素对萃取效果的影响 ,得到最佳萃取工艺 :夹带剂加入量为 5% ,纯度为 80 % ,萃取压力为 3 0 Mpa,温度为 50℃ ,时间为 1h。

高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法测定竹叶花椒中2种主要成分的含量

目的建立测定竹叶花椒中羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素含量的高效液相色谱法和紫外-可见分光光度法。方法采用高效液相色谱法,色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-水(40∶60,V/V),检测波长为270 nm,流速为1mL/min,进样量为10μL,测定羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素的总含量;采用紫外-可见分光光度法,以羟基-α-山椒素为对照品,于270 nm波长处测定酰胺类物质的总量。结果高效液相色谱法中,羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素进样量分别在0.07911~3.95550μg和0.0095~0.4736μg范围内与峰面积线性关系良好;平均加样回收率分别为97.28%和98.90%,RSD分别为1.79%和1.56%(n=6);紫外-可见分光光度法中,羟基-α-山椒素质量浓度在0.7910~7.9100μg/mL范围内与吸光度线性关系良好,平均加样回收率为95.84%,RSD为0.78%(n=6)。结论所建立的含量测定方法准确、可靠,可用于竹叶花椒药材质量的控制。

筋骨止痛凝胶中功效物质的体外透皮扩散行为研究

该文探究筋骨止痛凝胶中功效物质的体外透皮扩散规律。采用干加热全自动透皮扩散取样系统,对筋骨止痛凝胶透皮扩散研究方法进行单因素考察,并建立筋骨止痛凝胶透皮接收液中阿魏酸,洋川芎内酯Ⅰ,肉桂酸,羟基-ε-山椒素,羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素6种功效成分的HPLC含量测定方法,对16 h内成分的透皮扩散规律进行研究。试验结果显示,优选筋骨止痛凝胶透皮扩散研究方法为大鼠皮作为透皮屏障,生理盐水作为接收介质,给药剂量0.3 g,采用乙酸乙酯萃取对接收液样品进行处理测定。透皮扩散结果显示,阿魏酸、肉桂酸和洋川芎内酯Ⅰ透皮规律表现为0~8 h释放显著增加,8~16 h释放减缓,释放过程扩散和溶蚀协同进行,阿魏酸、肉桂酸透皮扩散规律遵循Higuchi和Ritger-Peppas方程,洋川芎内酯Ⅰ遵循Higuchi方程。羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素透皮扩散曲线显示16 h内持续释放,释放表现为骨架溶蚀,扩散规律遵循零级方程,一级方程和Ritger-Peppas方程。研究结果表明,筋骨止痛凝胶中功效物质阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、肉桂酸、羟基-ε-山椒素、羟基-α-山椒素和羟基-β-山椒素16 h内释放规律具有一定的缓控释作用,可维持平稳的血药浓度,12 h成分累积透过量能到达24 h的80%,符合其每日2次的临床用药规律。