山羊β乳球蛋白基因的克隆及其在转基因小鼠乳汁中的高效表达

通过长距离PCR从山羊基因组DNA分两段扩增山羊β乳球蛋白(β lactoglobulin,BLG)基因,扩增出的两个片段分别克隆到T载体上,利用BLG基因序列自身存在的NarI单酶切位点进行拼接,获得了全长为7.2kb的山羊BLG基因克隆,并构建了它的真核表达载体,经酶切鉴定和序列分析证实了克隆的正确性。用线性化的BLG基因显微注射小鼠受精卵以建立转基因鼠,经PCR和Southern印迹分析证实获得了6只首建者(Founder)转基因小鼠(3♀,3♂),在泌乳期采集两只F0代转基因雌鼠乳汁并用ELISA测定山羊β乳球蛋白的含量,其表达水平分别为23.49mg/mL和2.19mg/mL。

猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定。结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1。乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础。

人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达

目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素(TPO)的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5′端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和P1A33种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT>pB3.9T>pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5′端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。