外源基因转染山羊体细胞的整合效率研究

为了探讨影响山羊体细胞中外源基因整合效率的因素,采集胎羊和小羊皮肤并制备成纤维细胞,采用"Lipofectamine LTX"脂质体转染试剂包埋外源基因,分别导入上述细胞中,比较同一种外源基因载体(人凝血因子Ⅸ)转染至不同个体和类型的羊细胞,以及不同载体(人凝血因子Ⅸ、人转铁蛋白和牛催乳素)转染至同一个体羊细胞的整合效率的差异.通过药物筛选得到单细胞簇,经定量PCR计算外源基因的整合效率.同一种外源目的基因载体转染小羊成纤维细胞的整合效率显著高于胎羊成纤维细胞(P<0.05);而不同目的基因载体转染同一个体羊细胞,其细胞的整合效率与转染载体的片段大小有关.由此可知,小羊成纤维细胞外源基因整合频率优于胎羊细胞,且载体片段的大小影响外源基因转染的整合频率.

体细胞克隆波尔山羊0～12月龄生长发育测定研究

通过对2只体细胞克隆波尔山羊(单胎母羊)和与其相同饲养条件下自然繁殖出生的波尔山羊(单胎母羊)0～12月龄的体重、体尺指标测定,初步分析了其生长发育的变化规律。结果表明:①克隆羊初生重、体尺略高于自繁羊,但差异不显著(P>0.05);②克隆羊3月龄、6月龄、12月龄体重指标明显高于自繁羊,差异极显著(P<0.01);③克隆羊3月龄、6月龄、12月龄体尺指标除体长略高于自繁羊,差异不显著(P>0.05)外,体高、胸围均明显高于自繁羊,差异极显著(P<0.01)。④克隆羊生长发育速度前期快,逐渐减慢,后期趋于正常。0～3月龄阶段总增重、日增重明显高于自繁羊,差异极显著(P<0.01);3～6月龄阶段高于自繁羊,差异显著(P<0.05);6～12月龄阶段略高于自繁羊,差异不显著(P>0.05)。

五羟色胺对体外培养山羊黄体细胞增殖的影响

为了探讨5-羟色胺(5-HT)与山羊黄体细胞的生长是否存在密切的关联性,揭示其在黄体发育中的生物学作用,采用胶原酶Ⅱ消化法获得原代山羊黄体细胞并用催产素(OT)染色对细胞进行鉴定,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度5-HT对山羊黄体细胞的影响,免疫组织化学染色法(SP法)检测山羊黄体细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达。MTT法结果显示,5-HT对山羊黄体细胞的增殖起到促进作用,促增殖的浓度范围在10^(-8) mol/L^10^(-4) mol/L,浓度越高,促增殖作用越明显。免疫组织化学染色法证实,5-HT能够使山羊黄体细胞中PCNA蛋白的表达增多。结果提示,5-HT可能是通过促进PCNA蛋白的表达来实现对山羊黄体细胞的促增殖作用。5-HT在黄体发生、发展过程中发挥的重要作用及相关分子机制的初步揭示都为生殖内分泌系统的研究奠定了理论基础。

用KOSR优化山羊克隆胚的培养体系

体细胞核移植重构胚的体外培养一直是影响山羊克隆效率的一个重要因素,为了排除成分复杂的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)对克隆重构胚发育的潜在抑制作用,本研究采用成分明确的血清替代品(knockout serum replacement,KOSR)进行山羊体细胞克隆重构胚胎的体外培养,并比较KOSR与FBS对重构胚的发育效率的影响。结果显示,KOSR组山羊重构胚培养体系的分裂率明显高于FBS组(80.67±0.63%.vs 49.02±4.85%,P<0.01),2组在重构胚重编程过程中的8细胞率具有显著差异(48.89±1.92%vs.28.59±3.13%,P<0.05);2组不同培养体系的受孕率也有明显不同(33.3%vs.10%,P<0.05)。研究结果表明,KOSR培养体系能有效提高山羊重构胚的发育效率,特别是有利于重构胚的早期重编程,为获得健康的转基因克隆山羊奠定了良好的基础。

人工锌指核酸酶突变EGFP基因的功能分析

锌指核酸酶技术在基因定点修饰中具有效率高和特异性好等特点,并成功应用于数十种生物。目前,该技术是否能应用羊上尚未报道。为了敲除转基因山羊标记基因(EGFP),构建了一对针对EGFP外显子上的锌指核酸酶表达载体,将其电转染至转EGFP基因胎儿成纤维细胞中,研究了锌指核酸酶突变EGFP基因的效率和方式,利用基因显微注射单细胞获得获得的转基因(EGFP)细胞系作为锌指核酸酶的靶细胞。结果显示,通过锌指核酸酶的突变作用,转染后的细胞发绿色荧光比例下降,测序结果显示在EGFP外显子中插入1个碱基G,导致编码EGFP基因的阅读框改变,从而起到基因突变的作用。结果表明,文中构建的锌指核酸酶对EGFP基因有突变作用,可以为以后获得无标记基因供核细胞进行体细胞核移植生产克隆羊奠定基础。