山羊副流感病毒3型的研究进展

山羊群中普遍存在山羊副流感病毒3型(CPIV3)病毒的感染,严重危害养羊业的健康发展。该文简要介绍了CPIV3的临床表现、流行病学、病原学、致病性、诊断技术、疫苗研发及防控技术等内容。研究表明,研制出安全有效的疫苗是控制山羊副流感病毒3型的方法,对预防由CPIV3引起的呼吸道疾病具有重要意义。

一起肉牛副流感病毒3型、巴氏杆菌、牛支原体混合感染的诊治

牛呼吸道综合征往往是多种病原体混合感染引起,致病机制复杂。云南省昆明市某肉牛养殖场部分犊牛出现了以咳嗽、气短、流鼻涕、腹泻等呼吸道症状为主要表现的呼吸道疾病,随后多头相继死亡,剖检主要病变为气管、胃黏膜、小肠出血,肺脏肝变,肝脏出血肿大,心脏出血,心包黏连等;经采病料用常见呼吸道疾病病原(牛病毒性腹泻病毒,牛冠状病毒,牛副流感病毒3型,牛呼吸道合胞体病毒,牛疱疹病毒1型,多杀性巴氏杆菌,溶血性曼氏杆菌,牛支原体)8联PCR检测试剂盒检测,结果为副流感病毒3型、多杀性巴氏杆菌、牛支原体混合感染。经用加米霉素、10%替米考星和20%氟苯尼考等大环内酯类药物治疗,结合加强饲养管理,多数病牛恢复了健康。

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta(DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell,MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes,ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID50及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^(-1),Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基因的转录上调。与对照组细胞相比,山羊IFN-α显著下调MDBK细胞中CPIV3的病毒滴度,Western blot结果显示,山羊IFN-α孵育显著下调CPIV3非结构蛋白C的表达水平。山羊IFN-α对CPIV3在MDBK细胞中的增殖具有显著抑制作用。本研究扩展了I型干扰素的研究范围,为CPIV3等反刍动物疫病的防控提供新的思路。

一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

从黑龙江省某牛场当中患有呼吸系统疾病的病牛鼻拭子中分离到一株病毒,该病毒在MDBK细胞上能够产生典型的病变。经免疫荧光鉴定表明成功分离到一株牛副流感病毒3型,命名为HLJ1。将病毒的M基因与GenBank中已发表BPIV3毒株的M基因进行同源性比较及系统进化分析,结果表明HLJ1与BPIV3c型参考毒株NX49的同源性最高为99.7%,因此HLJ1分离株属于c基因型BPIV3。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。

牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起牛呼吸道综合征的分析

为查明广西某牛场一起以呼吸道症状为主的病因,试验采用流行病学调查法、临床观察法、病理解剖观察法、病原分离培养和RT-PCR/PCR扩增法进行诊断,并对分离株进行药物敏感性试验。牛副流感病毒3型和牛支原体为阳性,牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒等为阴性。该起病例由牛副流感病毒3型和牛支原体混合感染引起的,导致本场牛大批发病死亡的原因是由外购牛传染引起。

山羊源副流感病毒3型的分离与分子鉴定

2013年下半年至2014年3月,江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病。采集不同发病场鼻拭子和血清样品,检测呼吸道相关病原,在大部分样品中检测到副流感病毒3型。将阳性病料接种于MDBK细胞,连续传代5代,经RT-PCR和血凝试验检测证实分离到病毒,命名为JS2013。扩增完整的M基因,进行进化分析表明该毒株不同于牛和人副流感病毒3型,具有独特的基因特征。这是国内外首次报道山羊源副流感病毒3型的分离鉴定。

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的miRNA表达谱变化分析

本研究旨在分析山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和正常MDBK细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA在CPIV3感染过程中的作用及其调控机制。将CPIV3感染MDBK细胞,利用高通量测序技术检测分析MDBK细胞中miRNA表达谱,并筛选差异表达的miRNA。对靶基因进行GO注释和KEGG富集。结果显示,有37个miRNA显著差异表达(P<0.001),其中18个miRNA在病毒感染中上调,19个miRNA在病毒感染中下调。经RT-qPCR方法验证5个差异表达的候选miRNA,结果与高通量测序分析有很好的一致性。进一步GO功能注释表明:差异表达的miRNA靶基因生物学功能相对集中在免疫调节、细胞生物调控及细胞新陈代谢等生物过程。这些靶基因参与多种细胞的信号通路,包括细胞黏附分子、B细胞受体信号通路、MAPK信号通路、代谢通路、黏合斑、钙离子信号通路和趋化因子信号通路等。本研究为进一步探讨CPIV3致病机制奠定了基础。

MiR-222对山羊副流感病毒3型复制的影响

为探讨miR-222对山羊副流感病毒3型(CPIV3)复制的影响及其机制。本研究将miR-222模拟体转染MDBK细胞,接种CPIV3病毒液,收集上清和细胞,测定病毒效价和干扰素(IFN)含量;通过Target Scan和miRanda等生物信息学软件预测miR-222调控的靶基因,用双荧光素酶报告系统验证其靶基因,RNA干扰技术研究靶基因对CPIV3复制的影响。结果显示,miR-222模拟体能抑制CPIV3复制,转染miR-222组IFN的表达水平较高,且病毒复制效价(10^(2. 5)TCID_(50)·0. 1 mL^(-1))显著低于miRNA阴性对照组(10^(3. 3)TCID_(50)·0. 1 mL^(-1));双荧光素酶报告系统验证和qPCR检测得出,miR-222可靶向结合IRF2的3'-UTR,并降解IRF2的mRNA和抑制IRF2蛋白表达;敲除IRF2的MDBK细胞感染CPIV3后,病毒复制效价(10^(2. 0)TCID_(50)·0. 1 mL^(-1))低于正常MDBK细胞组(10^(3. 2)TCID_(50)·0. 1 mL^(-1))。本研究表明,miR-222通过靶向降解IRF2 mRNA提高IFN表达水平来抑制CPIV3复制,为基于miR-222研制潜在抗病毒药物提供基础资料。

山羊副流感病毒3型和巴氏杆菌混合感染的诊断与病原分离鉴定

随着规模化养羊业的发展,肉羊呼吸道疾病流行普遍、发病严重、防治困难,给养殖业及养殖户造成较大的经济损失。为明确安徽某肉羊养殖场呼吸道疾病的病因,结合流行病学、临床症状、剖检病变观察、细菌学及病毒学检测与分离鉴定以及血清学检测对病因进行分析,结果表明该病是由山羊副流感病毒3型与巴氏杆菌混合感染所致。分离菌株对丁胺卡那霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、恩诺沙星和头孢曲松敏感,对青霉素、克林霉素和强力霉素不敏感。通过MDBK细胞成功分离获得山羊副流感病毒3型毒株,其M基因片段与已有毒株同源性达99%。血清学检测也进一步证实病毒的感染。这为临床上科学防控山羊呼吸道疾病提供了指导和借鉴。

山羊副流感病毒3型N蛋白原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

山羊副流感病毒3型可引起山羊呼吸道疾病,与支原体、细菌等混合感染引起广泛的发病与死亡,笔者拟通过建立基于N蛋白的间接ELISA抗体检测方法用于该病的监测。设计引物扩增目的基因N,克隆到质粒pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a-N,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组N蛋白并鉴定。通过条件优化建立ELISA抗体检测方法,并检测临床样品与HI试验进行比较。本试验成功构建重组质粒,诱导表达的蛋白质(47ku)经SDS-PAGE与Western blot鉴定,证明其正确表达且具有良好的抗原性与特异性。利用纯化的蛋白质作为包被抗原优化间接ELISA反应条件,确定其最佳抗原包被浓度为1μg·mL-1、血清稀释度为1∶200、血清作用时间60min、酶标二抗工作浓度为1∶6 000、二抗反应时间30min、底物显色时间10min。通过对138份临床血清样品检测发现其与HI试验结果符合率达88.41%。本研究建立的间接ELISA检测方法敏感、特异、准确,适用于临床样品的检测与血清流行病学调查。

山羊副流感病毒3型通过Caspase途径诱导气管上皮细胞凋亡

旨在揭示山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染气管上皮细胞后是否可诱导细胞发生凋亡,并对细胞凋亡的信号通路进行初步探究。本研究将CPIV3病毒液接种气管上皮细胞,在12、24、36、48、72和96 h收集培养物上清检测病毒增殖滴度;通过形态学观察CPIV3诱导气管上皮细胞病变(CPE)情况;采用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性检测试剂盒检测凋亡水平及相关指标;荧光定量PCR检测细胞凋亡分子mRNA表达水平;Western blot分析激活型Caspase-3蛋白表达变化情况。结果显示,CPIV3在气管上皮细胞中的增殖呈上升趋势,96 h能达到10 4.50 TCID 50·mL^-1;形态学观察发现,病毒接种后48 h出现细胞收缩变圆、脱落等CPE现象;流式细胞术检测及Caspase活性检测表明,感染组细胞出现细胞凋亡,48 h后细胞凋亡率达19.66%,且Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性随着时间延长逐渐升高;死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径细胞凋亡因子mRNA表达上调。Western blot分析揭示,激活型Caspase-3蛋白在病毒感染过程中被活化。本研究证实CPIV3感染可诱导气管上皮细胞凋亡,且Caspase途径在病毒诱导细胞凋亡的过程中发挥重要作用。

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞和BECs后7种ISGs mRNA变化分析

为探究山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞和气管上皮细胞(BECs)后的抗病毒免疫应答,本研究针对7种干扰素刺激基因(ISGs):IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2及RSAD2的基因序列设计特异性引物,经优化建立了检测7种ISGs的SYBR Green I荧光定量PCR方法。利用所建立的方法检测CPIV3JS2013株感染MDBK细胞和BECs 24 h、48 h和72 h后7种ISGs的m RNA转录水平。结果显示,在MDBK细胞中,CPIV3感染时间越长,7种ISGs的转录水平上调倍数越高,其中ISG15、Mx1、Mx2和RSAD2的m RNA转录水平上调量持续高于IFI6、OAS1Y和OAS1Z;而在BECs中,CPIV3感染后虽然IFI6、ISG15、OAS1Y、OAS1Z、Mx1、Mx2和RSAD2 m RNA转录水平均出现上调,但ISG15、Mx2和RSAD2的m RNA转录水平上调量高于IFI6、OAS1Y、OAS1Z和Mx1。结果表明,CPIV3 JS2013株可以刺激MDBK细胞和BECs中这7种ISGs的大量转录,本研究为进一步探究其抗病毒功能提供了实验依据。

山羊副流感病毒3型感染MDBK细胞的转录组分析

本研究旨在探究山羊副流感病毒3型(CPIV3)感染MDBK细胞后的转录组基因变化情况,丰富CPIV3转录组信息。取1MOI CPIV3JSHA2014-1病毒液感染MDBK细胞,设非感染正常细胞为对照,于24h后收获细胞,提取总RNA,利用Illumina HiSeqTM2500对感染组与对照组进行高通量测序,并用测序评估、基因注释等生物信息学方法进行分析。结果显示,差异表达基因共261个,其中表达上调140个,表达下调121个,经RT-qPCR方法验证8个差异表达的干扰素信号通路相关基因,结果与高通量测序一致。进一步GO分类结果显示,差异表达基因主要涉及细胞生物学进程、构成细胞的组分以及实现的分子功能三个方面,KEGG分析显示这些基因参与代谢、生物系统、细胞进程、基因信息进程和环境信息进程。本研究为深入探究CPIV3的致病机制奠定了基础。

牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究

目的针对黑龙江省近几年夏季奶牛经常发生以高热、气喘和流涎等症状为主的疾病,给畜牧业造成严重经济损失,本文旨在研究其病原因素及感染牛中和抗体的变化趋势。方法本研究采集爆发高热病的牛群中患病牛乳汁和鼻液进行病毒分离,经CPE和扫描电镜观察、理化特性试验、血凝试验、病毒中和试验以及RT-PCR方法鉴定分离的病毒,最后应用病毒中和试验跟踪监测5头典型发病牛中和抗体13个月。结果从病料中分离到一种RNA病毒,能够产生典型的细胞融合样CPE,有囊膜和栅栏样纤突,但是没有血凝性,能够与参考毒株牛副流感病毒3型抗血清发生病毒中和反应,HN基因的序列分析发现与牛副流感病毒3型HN基因同源性最高达99.6%。发病牛中和抗体跟踪监测结果显示康复期抗体效价是急性期的4倍以上,同时可见感染牛的中和抗体效价在6-8个月内能够维持在1:25～1:27,然后开始下降,最后维持在1:22～1:23之间。结论综上所述确定分离毒株是牛副流感病毒3型,进一步证实该病毒是引起本牛群高热病的病因之一,而且感染后中和抗体效价至少在6个月以内能够维持在较高的水平。

牛副流感3型病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛支原体多重PCR检测方法的建立

为建立检测牛副流感3型病毒(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛支原体(M.bovis)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BPIV3的HN基因、IBRV的g C基因、BVDV的5'UTR和M.bovis的oppD/F基因序列设计特异性引物,通过优化反应条件建立了一种可以同时检测以上4种病原的多重PCR方法。结果显示,该方法对牛呼吸道合胞体病毒、小反刍兽疫病毒、牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、牛源多杀巴氏杆菌A型和B型无特异性扩增,对BPIV3和BVDV的cDNA最低检测量分别为100 pg和1 ng,对IBRV和M.bovis的DNA最低检测量分别为10 pg和100 pg,具有较高的特异性和灵敏性。对临床33份鼻拭子样品和12份牛肺样品的检测结果与已发表文献中PCR方法的检测结果一致。本研究建立的多重PCR检测方法可同时对BPIV3、IBRV、BVDV和M.bovis进行检测,为这4种病原的诊断和检测提供了一种实用、便捷的方法。

牛副流感病毒3型NP单抗的制备及初步应用

为制备牛副流感病毒3型(BPIV3)核衣壳蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究利用原核表达并纯化的重组NP(rNP)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用以BPIV3为检测抗原的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株稳定分泌抗NP特异性MAb的杂交瘤细胞株(5E5)并制备腹水,采用rNP及BPIV3包被的ELISA效价分别是2×106和1.28×105。间接ELISA、western blot、IFA试验表明该MAb具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定该MAb亚类为IgG1/κ。特异性试验表明该MAb不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒反应。免疫组化试验表明该MAb可以检测BPIV3感染动物体内的病原。该MAb还可用于建立检测BPIV3病原及抗体的诊断方法,同时为研究NP的结构和功能提供了条件。

C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定

为了对宁夏地区患有呼吸系统疾病的舍饲牛进行病原鉴定,试验主要利用RT-PCR方法对样品进行牛副流感3型病毒(BPIV3)M基因序列扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行亚克隆。通过氨苄青霉素平板筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定并利用分子生物学软件与GenBank上参考序列进行同源性比对。测序结果表明,从样品中分离到了1株BPIV3,并命名为NX49,其M基因全长为1 056bp;进化分析表明,NX49隶属于BPIV3C基因型,其M基因与中国山东C型分离株SD0835具有较高同源性,核苷酸同源性为99.4%;理化分析表明,该毒株对温度、酸及有机物均敏感,高温孵育下Mg2+对该病毒无保护力;血凝试验表明,NX49对豚鼠红细胞凝集效价仅为1∶4,且仅在4℃孵育时出现凝集反应。本研究成功分离得到一株BPIV3C型毒株,这将有助于中国BPIV3分子进化规律及病毒流行特点的进一步研究。

牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立牛副流感病毒3型（BPIV3）双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法,本研究采用纯化的病毒分别免疫小鼠与家兔,制备鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）与兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）。以纯化的兔抗BPIV3 PAb作为包被抗体,鼠抗BPIV3 MAb作为检测抗体,采用棋盘滴定法确定DAS-ELISA的最适工作条件。结果显示,纯化的兔抗BPIV3 PAb与鼠抗BPIV3 MAb的效价分别为1：25 600和1∶12 800,均可与BPIV3病毒蛋白特异性结合。建立的DAS-ELISA方法捕获抗体最佳包被浓度为10μg/m L,37℃孵育1 h;检测抗体最佳工作浓度为2.5μg/m L,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min。判定的临界值为0.451。本研究建立的DAS-ELISA方法与牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒均无交叉反应,特异性较强。检测下限为103TCID50。批间和批内变异系数均小于10%,具有良好的重复性。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测,两者符合率为94.6%。本研究建立的检测BPIV3的DAS-ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)基因序列,利用在线软件Primer Explorer V4Software和Primer Premier 5.0,针对BPIV-3 NP基因序列的保守区设计并筛选了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立BPIV-3特异性检测的RT-LAMP方法。在Bst DNA聚合酶作用下,63℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物通过浑浊度比较、凝胶电泳和肉眼可视化进行判定。结果表明,该方法比RT-PCR敏感度更高,最低检出量可达0.069fg/μL。该方法可用于牛副流感病毒3型的实验室检测和临床初步诊断。

牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用

旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。