检测山羊嵴病毒的实时荧光定量PCR方法的建立和应用

山羊嵴病毒(caprine kobuvirus,CKoV)是国内山羊新发病毒,本试验目的是建立检测CKoV的实时荧光定量PCR方法,并对西南三省腹泻山羊粪样进行该病毒的检测。选择CKoV最保守的3D基因序列,设计3D基因引物,初步设计实时荧光定量PCR,经优化反应条件和反应体系,成功建立了检测CKoV的TB Green染料法实时荧光定量PCR方法。该方法在病毒浓度2.23×10^(2)~2.23×108 copies·μL^(-1)范围内线性关系良好,相关系数为0.9992,扩增效率为110%;此方法具有良好的特异性和稳定性,最低检测限为2.23×10^(1) copies·μL^(-1)。采用所建立的方法对2020年1—4月采集自四川、云南和重庆的共15个场79份山羊腹泻粪样本进行检测,结果CKoV的平均检出率为25.3%,场阳性率为53.3%。并且本试验获得了13个完整的CKoV 3D基因,遗传进化分析表明这13个3D基因具有独特的进化趋势。本研究为CKoV的分子检测提供了一种新的技术手段和基础流行病学数据。