Wnt通路中部分基因在绒山羊胚胎皮肤毛囊中的表达

已知绒山羊毛囊的发育受Wnt等信号通路控制,但Wnt通路相关基因在绒山羊胚胎毛囊启动和生长发育过程中的表达及作用机制尚不清楚。本文采用RNA-Seq技术对45 d,55 d和65 d的绒山羊胚胎体侧皮肤进行了转录组测序,鉴定Wnt通路相关基因的表达。RNA-Seq技术结合blast搜索,将转录组有效测序数据与云南黑山羊参考基因组序列(http://goat.kiz.ac.cn/GGD/download.htm)比对,获得了已知的Wnt通路(pathway hsa04310)中的123个相关基因(86.0%)。进而采用实时荧光定量PCR技术检测,验证了差异表达的Sfrp4、Wnt3、Wnt10a(上调)和Apc2(下调)基因在绒山羊胚胎不同时期皮肤中的表达量,初步探索了绒山羊毛囊在胚胎期启动、发育过程中,Wnt通路部分基因的表达模式,为进一步研究Wnt通路部分基因在绒山羊胚胎毛囊启动、发育过程中的作用机制提供了有意义的线索。

山羊胚胎皮肤的发育及β1整合素在发育中的表达

目的:观察山羊胚胎皮肤发育的过程以及在此过程中表皮干细胞的特异性标志β1整合素的表达状况,以定位表皮干细胞。方法:实验于2006-11/2007-05在西北农林科技大学动物科技学院组织胚胎学实验室完成。取8～18周龄山羊胚胎背部皮肤,用组织学方法,观察山羊胚胎皮肤发育的形态学变化;用免疫组织化学SP法,观察β1整合素在山羊胚胎皮肤发育过程中的表达特征。结果:①表皮于8～9周龄时开始发育,10周龄时表皮由三层细胞构成,在11周龄时可见有原始毛囊的出现,有少量张力原纤维的存在,并发现朗格罕斯细胞,12～13周龄时表皮细胞出现角化层、透明层及颗粒层的分化,可见汗腺,14～15周龄毛球上皮细胞索开始分化为外根鞘、内根鞘的原基和毛发的前体,在毛囊一旁出现皮脂腺,张力原纤维增多、变粗,并发现典型的桥粒结构,16～17周龄时表皮层变薄,毛开始形成,并随着发育逐渐长出体表。18周龄皮肤的结构渐趋成熟。②胚胎发育早期,基底层细胞胞浆内表达β1整合素,随着皮肤发育,β1整合素阳性细胞出现在毛囊隆突区和外根鞘。结论:①山羊胚胎表皮的发生优先于真皮的发生,在胚胎时期处于剧烈的分化阶段。②β1整合素的阳性反应定位于基底层,随着皮肤的发育也表达于毛囊隆突区和外根鞘,表皮干细胞的数量和分布的部位与皮肤的发育特点有关系。

山羊胚胎脊髓胶状质的形成和发育

对山羊胚胎脊髓胶状质发育的形态学变化进行了系统研究 ,结果表明 :1山羊脊髓胶状质在胚胎第 1 7周以后逐渐出现较多的神经元胞体和较大的淡染的神经元细胞核 ,提示胚胎第 1 7周龄是山羊脊髓胶状质神经元发育的关键时期 ;2山羊脊髓胶状质内神经纤维在胚胎第 1 1周时就已出现 ,而有髓神经纤维的髓鞘则在胚胎第 1 5周时形成 ,以后逐渐发育成熟 ;3山羊脊髓胶状质的胶质细胞发育较早 ,在胚胎第 6周末胶状质原基刚形成时 ,胶质细胞核已经开始分化 ,到胚胎第 1 8～ 1 9周时 。

细胞因子与激素对山羊胚胎体外生产的影响

随着商业性胚胎移植技术的推广应用和动物胚胎工程技术的深入研究，对胚胎和卵母细胞的需求量日益增加，单靠超排技术获得的胚胎或卵母细胞已远远不能满足科研和生产的需要，因而推动了卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）及体外胚胎生产（IVP）等胚胎工程技术的发展。牛体外受精技术日趋成熟，体外胚胎生产已经开始走向生产应用，但山羊体外胚胎的生产效率远落后于牛，且质量不稳定。优化培养条件是提高山羊胚胎生产效率和胚胎质量的关键。文献报道，将胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、白血病抑制因子（LIF）、干细胞因子（SCF）用于绵羊、小鼠等动物的细胞培养研究取得了较理想的效果，但未见将3种成分用于山羊的报道。

藏山羊胚胎毛囊的形态发生及β-catenin和SHH的两类表达模式

研究藏山羊不同部位毛囊形态发生的差异及其β-catenin和SHH的表达规律。选择胚龄（Ed）51-89藏山羊胚胎样品,采用组织芯片技术和EnVison免疫组织化学方法对其不同部位毛囊的形态发生及β-catenin,SHH,PCNA,K14的表达进行观察、分析和比较。结果表明,藏山羊胚胎各部位毛囊形态发生的时间、密度、大小等均有差异,这种差异与皮肤下对应的骨骼类型相关。通过数据分析比较发现,β-catenin和SHH在藏山羊毛囊形态发生过程中的表达有两种模式：分别是一种以间充质为主导的模式（主要见于肢端）,另一种是表皮为主导的模式（主要见于躯体大部分部位）。β-catenin与SHH在藏山羊胚胎毛囊形态发生过程中至少有两种表达模式,其中以间充质为主导的模式在肢端毛囊形态发生中可能具有重要作用。

山羊胚胎大脑皮层神经干细胞分离、培养与鉴定

目的 :从山羊胚胎大脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 :利用NBS培养和单细胞克隆技术在山羊胚胎大脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用免疫组化检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 :从胚龄 2 4～ 30d的新鲜山羊胚胎大脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论

山羊胚胎的卵裂与囊胚形成的光镜研究

山羊交配后的１．５ ，２．０，２．５，３．５，４．０ ，５．５，６．５ ｄ，胚胎分别发育到原核、２ 细胞、４ 细胞、８ 细胞、１６ 细胞、桑椹胚、囊胚期。超排处理情况下，山羊排出的多个卵，时间可能不一致，因而受精后胚胎发育阶段可能不同步，而出现差异。随着卵裂球逐步变小，其界限逐步模糊不清，到桑椹胚时发生形态的不一致，因此，此时为致密化时间。以交配后时间计算胚龄与以排卵后卵受精时间计算胎龄是一致的。山羊囊胚滋养层细胞与内细胞群外层细胞形态不一致， 因此， 从形态上可以认为山羊内细胞群一开始就是裸露的。

山羊胚胎心脏发生发育的形态学研究

应用光镜观察了山羊胚胎心脏的发生和发育过程 ,结果表明 :15日龄 2 0时的胚胎处于胚层分化阶段 ,中胚层上已有微血管发生 ;16～ 18日龄的胚胎在前肠门两侧发生两条对称的心内皮管 ;18～ 2 0日龄的胚胎在前肠腹面两条心内皮管合并成单管状心。同时 ,心管发生扭曲 ,心管内部开始分隔过程 ;2 0～ 34日龄的胚胎心脏的分隔基本完成 ;34～ 10 5日龄属于胚胎心脏进一步发育成熟的阶段。试验还发现山羊心骨骼中的纤维三角发生初期是由致密结缔组织构成 ,随着胚胎的发育转变为透明软骨 。

冷冻——解冻后山羊胚胎性别的染色体鉴定

对冻存于液氮中的山羊胚胎进行了染色体检查,性别鉴定只基于Y染色体的鉴识。在所有胚胎中,具1个或多个分裂相的桑椹或囊胚期的胚胎分别占54.5％和85.7％,对于桑椹期及囊胚期的胚胎,其性别鉴定成功率分别为50.0％与58.3％。

滑县建立波尔山羊胚胎移植基地

今年3月24日上午,新西兰佩特森国际贸易公司总经理约翰·佩特森在驻华大使馆秘书、商务参赞等官员陪同下,来到滑县畜牧局良种羊繁育场,详细询问了新西兰专家为波尔山羊进行胚胎移植手术情况,并为自己的合作企业"中新畜牧基因公司"举行挂牌开业仪式。这是全国唯一的波尔山羊胚胎移植基地。滑县是一个秸秆。

CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

出生前山羊大脑皮质的形成和发育

对山羊胚胎大脑皮质形成及其神经元发育的形态学变化进行了研究,结果表明:(1)山羊胚胎不同类型大脑皮质的皮质板形成时间顺序为旧皮质、新皮质→海马皮质,与种系发生规律相反,提示神经系统内部结构的形成并非完全符合种系进化,而与动物个体组织结构自身的发展相关。不同类型大脑皮质皮质板的分化顺序为古皮质→旧皮质→新皮质,与种系发生的顺序相符。(2)山羊胚胎海马皮质锥体细胞的发育较早,按由深到浅的次序发育,而海马皮质中的非锥体细胞于第19周开始发育。梨状叶皮质锥体细胞发育的较早,最先出现在深层,颗粒层第18周出现。大脑新皮质各层神经元发育顺序依次为:内锥体层→外锥体层、多形层→内颗粒层→外颗粒层。各种类型皮质的神经元在出生前都未发育成熟。

胚胎移植在养羊业中的作用、问题及改进意见

自1890年英国首次获得家兔的胚胎后代以来,世界各国纷纷开展胚胎移植的研究和应用,先后在绵羊、山羊、猪、牛等家畜移植获得成功,并得到广泛应用,尤其是在绵、山羊、肉牛、奶牛方面从上世纪80年代,就已经成为一种成熟的实用技术。我国在上世纪60年代获得了家兔胚胎移植后代,随后在绵、山羊、奶牛、肉牛、猪、水牛等家畜获得了移植后代。但在一个很长的时间内,我国的胚胎移植一直处于试验阶段。

上海交大证明人干细胞可存活山羊体内

近日，由上海交通大学医学遗传研究所黄淑帧教授领衔的课题组完成的成果发表在最新一期的《美国科学院院报》上．这一成果主要是在干细胞研究领域获得的重要进展。干细胞研究过去大多只能在培养基中进行，黄淑帧教授等科研人员首次在国际上将山羊作为实验动物．将人脐血造血干细胞注射到经过妊娠45至55天的山羊胚胎的腹腔中，成功建立了人源性干细胞在山羊体内长期存活的人／山羊异种移植嵌合体，这些山羊看上去与一般的山羊无异，可在它们的肝脏中，

Culture of Embryonic Stem Cell by Primordial Germ Cells of Down Producing Goat

[Objective] The paper was to establish embryonic stem cell system of goats. [Method] Numerous primordial germ cell colonies were derived from gonadal ridge and the surrounding tissues in 20 millimeter fetuses of down producing goat. Primordial germ cells and goats embryonic fibroblasts obtained from conceptus of equivaient gestational age were co-cultured. [Result] The colonies showed some characteristics of embryonic stem cells, such as the morphology of nest-like, they continued to be AKP positive and the ability to be continuously passed [Conclusion] These cells were pluripotent and ES-like cells.