山羊酪蛋白不同酶解产物特性的研究

比较了四种酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、Alcalase及自制的枯草芽孢杆菌蛋白酶)对山羊酪蛋白的水解能力。水解度动态测定发现,酶解速度从高到低依次为Alcalase、枯草芽孢杆菌蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶;当40℃水解3h左右,水解度即达到相对稳定的最大值,依次为34.61%、25.28%、19.08%和7.22%。酶解物的SDS-PAGE分析发现,Alcalase、枯草芽孢杆菌蛋白酶能将山羊酪蛋白充分降解成小肽或游离氨基酸,而胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解物中还包含14kDa左右的大肽。山羊酪蛋白对四种酶的敏感程度均高于牛酪蛋白。山羊酪蛋白的胃蛋白酶解物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有一定抑制作用,枯草芽孢杆菌蛋白酶酶解物具有较强的超氧负离子自由基(O2-·)清除能力,清除率达到50.22%,是相同浓度维生素C(73.73%)的68%,四种酶解物清除O2-·的能力与水解程度呈正相关。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1- β6 .7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织。通过RT-PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性。结果 :构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性。说明构建具有较长 5′端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。

山羊β-酪蛋白启动子指导的通用表达载体及乳腺暂时表达系统

为了实现外源蛋白在动物乳腺中的特异性高效表达 ,利用山羊 β-酪蛋白 5′端 1.132 kb的侧翼调控序列、牛生长激素基因 poly A ( BGHPA)序列、基质结合区 ( matrix attachment region,MAR)和多克隆位点 ( MCS) ,构建了乳腺组织定位通用表达载体 p MRPA,鉴定正确后 ,将 2 .1kb的人组织型纤溶酶原激活剂 ( tissue- type plasm inogen activator,t PA) c DNA克隆到 p MRPA多克隆位点 ,获得重组表达载体 p MRPA- t PA。在不同的泌乳时间 ,使用不同的包裹剂 ,采用不同的剂量 ,将 p MRPA- t PA注入泌乳期山羊乳腺组织进行暂时表达。结果显示 ,所构建的乳腺组织特异性通用表达载体能够有效地指导目的基因的高效表达。通过乳腺暂时表达试验进一步发现 ,泌乳稳定期表达效果最好 ,t PA表达水平在 2 .0 2 0～ 6 .95 9mg/ L ;表达量随 DNA用量的增加而提高 ;使用普通包裹剂和裸质粒相比 ,普通包裹剂对表达效果无明显影响。本试验对乳腺暂时表达系统进行了系统性研究 。

山羊β-酪蛋白基因启动区指导人血清白蛋白在转基因小鼠乳汁中的高效表达

构建了包含山羊β-酪蛋白基因启动区5′端上游调控序列和外显子1, 2及内含子1在内的乳腺表达载体, 并与人血清白蛋白(hALB)小基因(含全长cDNA序列及其内含子1)构建成融合基因. 鼠尾静脉注射实验表明, 该融合基因能在小鼠乳腺中特异表达. 应用显微注射方法将该融合基因导入小鼠受精卵, 并将受精卵移植于假孕母鼠, 共获得33只F0代小鼠, 经PCR和Southern印迹杂交证实, 有8只小鼠(5♀, 3 ♂ )基因组中整合有hALB基因, 整合率为24.2%(8/33). Western blot分析表明, 在5只雌性整合小鼠中有3只表达了hALB蛋白, 放射免疫法测定其乳汁中hALB含量分别为3.54, 0.21和3.03 g/L.

不同启动子对于牛催乳素表达的调控作用

在细胞水平上比较不同启动子对于牛催乳素(bPRL)表达的调控作用。分别构建了以CMV启动子、牛催乳素基因启动子和山羊β-酪蛋白基因启动子作为调控元件的bPRL真核细胞表达载体,分别命名为pCMV、pPRLP和pP1A3。将3种载体分别转染小鼠垂体瘤细胞和小鼠乳腺上皮细胞,使用RT-PCR和定量RT-PCR分析3种启动子启动bPRL在2种细胞系中的表达效果。pCMV在2种细胞中有效表达bPRL;pPRLP在2种细胞中的表达效果与pCMV接近;pP1A3不在垂体细胞中表达,在乳腺细胞中表达。pP1A3具有乳腺表达特异性;pPRLP能够在垂体和乳腺中高表达,在其他组织的表达特异性有待进一步研究。

人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达

目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素(TPO)的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5′端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和P1A33种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT>pB3.9T>pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5′端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。