山葡萄类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因的表达分析

为了探究VAm3GT蛋白表达和在山葡萄体内酶学特征及生物学功能,进一步证实克隆所获得目的基因的准确性。利用实时定量PCR法对山葡萄果皮8个不同转色时期类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(VAm3GT)的表达量进行了分析,并通过双酶切、连接转化等方法将VAm3GT基因克隆到原核表达载体pET28a上,构建原核表达重组质粒pET28a-VAm3GT。重组质粒转化至E.coli BL21后经不同浓度的IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析表明,在适宜的IPTG诱导浓度下,VAm3GT基因在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达的融合蛋白分子质量约为50.19 ku,成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达。

转UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-糖基转移酶基因的高山红景天叶绿素荧光特性

以高山红景天为试材,采用IMAGING-PAM调制叶绿素荧光成像系统,测定了转UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-糖基转移酶基因FaGT1的高山红景天及转FaGT1的RNAi作用基因FaGT1i的高山红景天的叶绿素荧光参数,分析转UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-糖基转移酶基因的高山红景天叶片的叶绿素荧光特性,为研究红景天种质改良提供科学依据。结果表明:当光照强度为55μmol·m^(-2)·s^(-1)时,转FaGT1基因高山红景天的光系统Ⅱ的最大量子产量与高山红景天对照组和转FaGT1i基因高山红景天无显著差异,光系统Ⅱ潜在活性、非光化学淬灭系数/光化学淬灭系数和实际量子产量显著高于高山红景天对照组和转FaGT1i的高山红景天,但是调节性能量耗散的量子产量、非调节性能量耗散的量子产量则相对较低。另外,通过在不同的光照强度下,对光系统Ⅱ电子传递速率、光化学淬灭系数和非光化学淬灭系数进行了分析,得出转FaGT1基因高山红景天的光系统Ⅱ电子传递速率、非光化学淬灭系数呈先上升后稳定的趋势,显著高于高山红景天对照组和转FaGT1i的高山红景天;但是光化学淬灭系数呈先下降后平稳的变化趋势,与对照及转FaGT1i基因高山红景天无显著差异。转FaGT1基因高山红景天的光系统Ⅱ原初光能转换效率和潜在的光合活力均增强,植物自身的能量代谢得到提高,该研究结果为高山红景天的新种质培育提供了科学依据。

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486 kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT(P51094.2)的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。

滇牡丹类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因的鉴定与表达分析

以野生滇牡丹为试验材料,以其转录组数据为基础,采用反转录PCR技术克隆得到一个具完整开放阅读框的类黄酮7-O-葡萄糖基转移酶基因(Pd7GT),并通过生物信息学分析手段、基因表达对该基因进行分析。结果显示:该基因全长1 446bp (Gen Bank登录号为KX394687),可编码481个蛋白氨基酸;生物信息学分析发现Pd7GT蛋白C末端含有典型糖基转移酶识别区(WAPQV)和UDP-葡萄糖基配体绑定位点(HCGWNS)的PSPG盒子,其蛋白序列GWAPQVMILEHEAVGGFVTHCGWNSTLEGISAGLPLVTWPIFAEQFYNEK,与可可(XP_007042481)、Herrannia umbratica (XP_021298085)、毛果杨(XP_006379195)、巨桉(XP_010066837)等以葡萄糖为糖基配体的类黄酮7-O-糖基转移酶聚为一类; Pd7GT基因在组织茎中表达量最高、不同花发育时期的花谢期表达量最高、不同颜色花瓣中黄花花瓣表达量最高。本研究为滇牡丹糖基转移酶异源表达、分子育种等研究提供一定的基础,为未来通过基因工程培育具新颖花色和抗性的滇牡丹新品种提供必要材料。

唐古特白刺类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(NtUFGT)的克隆与功能分析

花青素是植物体内重要的黄酮类次生代谢产物,其强大的抗氧化能力对植物抵抗由各种非生物胁迫带来的氧化损伤发挥着重要的作用。本研究基于转录组数据,从唐古特白刺cDNA中克隆得到一个类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因,将其命名为NtUFGT。该基因开放阅读框长度为1407 bp,编码468个氨基酸,预测该基因编码的蛋白质相对分子质量为51.37 kDa。多重序列比对分析结果显示,其编码蛋白属于UDP-glycosyltransferases蛋白家族。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在唐古特白刺中的表达模式,发现该基因的表达具有组织特异性,由高到低依次为花>果实>茎>叶>根;同时该基因能被聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)等非生物胁迫强烈诱导表达。构建该基因的真核表达载体pPZP221:35S:NtUFGT,使用花序浸染法转化拟南芥并筛选至T3代,RT-PCR验证表明,NtUFGT基因在转基因拟南芥3个株系中均明显表达。测定干旱胁迫条件下野生型(WT)和转基因拟南芥(OE株系)生长状况和抗逆相关生理生化指标,结果发现转基因拟南芥生长状况明显优于野生型,根长更长,鲜重和叶绿素含量更高,同时OE株系积累了更多的花青素和总黄酮。与表型一致,相较于WT,OE株系具有更高的抗氧化酶活性[超氧化物歧化酶(SOD);过氧化物酶(POD);过氧化氢酶(CAT)],积累了更多的还原性谷胱甘肽(GSH)和脯氨酸,同时其丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)含量显著低于WT;基因定量分析结果显示,OE株系拟南芥中抗逆相关基因AtCAT1、AtPOD1、AtRD29A及脯氨酸合成基因AtP5CS的表达量明显高于WT。以上结果说明,NtUFGT能有效提高转基因拟南芥中花青素和总黄酮含量,赋予植物更强的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而增强了植物对干旱胁迫的耐受性。

马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析

根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosumcv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA。序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员。用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花色苷的积累是相关的。

中国水仙类黄酮3-氧-葡糖基转移酶基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE技术,从中国水仙上分离克隆得到1个葡糖基转移酶基因,命名为Nt3GT,其cDNA全长1 682bp,包含有1个1 461bp完整阅读框架(ORF),编码487个氨基酸,具有Glycos_tranf_1superfamily蛋白保守区。系统进化分析表明,中国水仙与马铃薯属的3GT亲缘关系最近。半定量RT-PCR结果显示,Nt3GT在叶片和花中均有表达,各个时期的叶片中表达量稳定,但花中的表达量不稳定,在抽葶期花苞未检测到表达,在盛花期的表达最高。

山葡萄UDP-葡萄糖:类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)cDNA的克隆和分析

用RT-PCR和SMARTRACE技术克隆了山葡萄3GT基因的全长cDNA序列。GenBank登录号为FJ169463,3GTcDNA全长1477bp,包括开放阅读框1371bp,编码456个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为50.19kDa,等电点为5.98,是不稳定蛋白。该基因属于UGT超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄(AB047098)、美洲种葡萄(EF630356)和拟南芥(AY072325)等植物的3GT氨基酸序列的同源性系数分别为98%、97%和59%。

彩色马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因(3GT)的生物信息学和表达分析

类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）能催化无色的花色素生成有色的花色苷。本研究采用RT-PCR法从彩色马铃薯中克隆了3GT基因,并对其进行了生物信息学分析和组织表达模式分析。结果显示,3GT基因编码448个氨基酸残基,具有信号肽但无跨膜结构域,还有一定的亲水性,定位于细胞质。同源比对表明3GT与茄子等茄科植物同属一簇,亲缘关系最近,与玉米等单子叶植物亲缘关系较远。3GT蛋白主要的二级结构元件为α-螺旋和无规则卷曲,且只有一个功能结构域,即氨基酸序列中的93~407区段,它与UDP-glucoronosyl、UDP-glucosyl transferase的功能结构域相匹配,因此,3GT属于UDPGT型糖基转移酶超家族的一员。组织特异性表达结果表明：3GT相对表达量和花色苷含量均是块茎高于叶片,它们的变化趋势基本一致,花色苷含量较高的器官,其3GT的相对表达量也较高,说明花色苷的积累与3GT的表达正相关。本研究可为花色苷积累的生化及分子机制研究奠定基础,并为进一步研究该基因在花色苷合成途径中的调控功能提供理论依据。

山葡萄UDP-葡萄糖:类黄酮5-O-葡萄糖基转移酶(5GT)等位基因的克隆与分析

山葡萄中大量的双糖苷花色苷严重影响山葡萄酒品质,而5GT是合成双糖苷花色苷的关键酶。研究不同葡萄品种间5GT等位基因的差异,为抑制双糖苷花色苷的合成奠定基础,对提高山葡萄酒的品质有重要意义。本研究克隆了‘赤霞珠’、‘左山一’、‘哈桑’和‘左红一’中的5GT等位基因,并用软件对其进行了序列分析和生物信息学分析,共获得了7个5GT等位基因,均位于葡萄9号染色体上,分别编码297~464个氨基酸。序列分析结果表明,4个5GT等位基因由于基因突变可能丧失了5GT功能;7个5GT等位基因均没有信号肽,属于GT1家族中的5GT亚家族。不同葡萄品种中的5GT等位基因存在一定差异,推测这7个5GT等位基因中可能只有3个5GT可以合成双糖苷花色苷。

山葡萄类黄酮-5-O-葡萄糖基转移酶基因(5GT)的克隆表达及遗传转化分析

为探究5GT基因在山葡萄花色苷合成过程中的表达规律及作用,以山葡萄(Vitis amurensis)为材料,利用RT-PCR技术克隆山葡萄5GT基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为GU237133),将该基因命名为Vam5GT并对该蛋白进行生物信息学分析预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测Vam5GT基因在山葡萄8个不同转色时期的表达规律,将克隆获得的Vam5GT基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli Bl2(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。并构建表达载体pC5GT并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化。结果显示:克隆获得的Vam5GT cDNA全长1 497 bp,开放阅读框1 347 bp,编码448个氨基酸,该基因表达产物相对分子质量为49.84 ku,等电点为5.23,是不稳定蛋白。该基因属于UDPGT超基因家族,不包含信号肽。Vam5GT在山葡萄花后4周的果皮中表达丰度最高,其他时期表达逐渐下降;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,在含50 mg/L Kanomycin的培养基上对拟南芥T_0代种子进行筛选,先后得到2个阳性幼苗,转化率为0.05%。对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性。

桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。

刺葡萄愈伤组织UFGT基因克隆及表达分析

为从细胞水平上揭示刺葡萄3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因调控花青素合成的功能,以刺葡萄愈伤组织为试验材料,根据刺葡萄愈伤组织转录组UFGT序列片段,利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到VdUFGT基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,VdUFGT基因cDNA和DNA开放阅读框(ORF)分别为1 371 bp和1 448 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码456个氨基酸,为带负电荷的不稳定的亲水性蛋白,具有一个UDPGT结构域,是UDPGT超家族成员,包含UDP-黄酮糖基转移酶特征区域。由UFGT同源基因编码蛋白所构建的系统发育树,与植物进化的关系相一致,6个葡萄属植物聚为一支。RT-qPCR分析表明,刺葡萄红色愈伤组织VdUFGT转录水平极显著高于白色愈伤组织,培养25 d的2个细胞培养物差异可达79倍;在刺葡萄愈伤组织连续培养过程中,红色愈伤组织中Vd UFGT转录水平变化幅度较大,在愈伤组织快速生长中期和衰老初期分别出现峰值,而刺葡萄白色愈伤组织VdUFGT转录水平与红色愈伤组织相比变化幅度不大,且始终维持在一个较低的水平。说明VdUFGT对刺葡萄红色愈伤组织细胞培养物中的花青素生物合成有重要的调控作用,这种调控作用主要发生在刺葡萄愈伤组织细胞快速生长中期和细胞衰老初期。本研究结果为进一步阐明VdUFGT调控刺葡萄细胞花青素合成的机制奠定了理论基础。

芜菁UF3GT基因的克隆及表达特性

目的：克隆‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的UDP-葡萄糖：类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶（UF3GT）基因并研究其表达特性。方法：利用RT-PCR方法克隆‘津田’芜菁BrUF3GTl基因和‘赤丸’芜菁BrUF3GT2基因，并进行生物信息学分析；通过Northern杂交检测BrUF3GTl和BrUF3G死基因的UV-A诱导表达特性；对BrUF3GTl和研U乃G他基因进行原核诱导表达。结果：BrUF3GTl和BrUF3GT2的开放读框为1407bp，编码468个氨基酸残基；氨基酸序列分析显示，BrUF3GTl和BrUF3GT2与拟南芥UF3GT的同源性为87％，从第16～453位氨基酸残基的肽段具有糖基转移酶家族成员的结构域；所UF3G丌和BrUF3GT2基因具有高度同源性，核苷酸序列在7个位点存在差异，推导的氨基酸序列在1个位点存在差异；Northern杂交结果显示，UV-A可以诱导西＂3G＂和BrUF3GT2基因表达，基因的表达量与处理时间相关；原核诱导表达及纯化后可以获得相对分子质量分别约为51．88×10。和51．89~10。的BrUF3GTl和BrUF3GT2蛋白。结论：克隆了‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁的叩3Gr基因，为初步阐明2种芜菁的花青素生物合成机理奠定了实验基础。

马铃薯3GT基因转化拟南芥引起花色苷大量积累

为了验证马铃薯野生种3GT(UDP-glucose:flavonoid 3-0-glucosyltransferase,类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶)基因的功能,构建了携带CaMV35S启动子的表达载体pG3GT并转化农杆菌GV3101。用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50mg/LKan的培养基上对T0代种子进行筛选,先后得到4个阳性幼苗,转化率为0.13%。对移栽成活的3株抗性植株进行PCR检测为阳性,Southern blot分析有2株表现为阳性并为单拷贝整合,其中一株的叶片和茎杆颜色变成紫红色;经花色苷含量的测定表明其含量比野生型植株高出7.01倍。

‘红巴梨’果皮UFGT基因的克隆及表达分析

以‘巴梨’红色芽变品种‘红巴梨’果皮为材料,采用同源克隆技术和RACE结合的方法,克隆了UFGT(UDP-葡萄糖:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶)蛋白的部分cDNA,命名为Pc UFGT。结果表明:该cDNA片段长为1 089 bp,与苹果UFGT基因序列一致性达89%,氨基酸序列同源性为85%,含有糖基转移酶的UDPGT、COG1819和MGT等保守域。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在‘红巴梨’幼果期表达强度约为‘巴梨’的2倍,而果实成熟期表达强度略低于‘巴梨’;该基因在‘红巴梨’果肉中不表达。

窝儿七的化学成分研究

目的 研究窝儿七(中华山荷叶Diphylleia sinensis干燥根茎)中的化学成分。方法 运用硅胶、AB-8大孔吸附树脂、ODS、MCI和Sephadex LH-20等柱色谱和半制备高效液相色谱对其化学成分进行分离纯化,通过IR、UV、MS、NMR等波谱分析技术,结合理化性质分析,鉴定化合物结构。采用DPPH自由基清除实验,测试化合物1、4、10、11、20的抗氧化活性。结果 从窝儿七95%乙醇和50%乙醇提取物中分离得到21个化合物,分别鉴定为[4,5-二羟基-2-(1-羟基乙基)苯基][(4-羟基)苯基]甲酮(1)、(+)-7′-甲氧基落叶松树脂醇(2)、7′R-羟基落叶松树脂醇(3)、3-甲氧基槲皮素(4)、二氢槲皮素(5)、二氢山柰酚(6)、山柰酚(7)、槲皮素(8)、podoverine B(9)、大黄酚-1-O-β-D-葡萄糖苷(10)、大黄酚-8-O-β-D-葡萄糖苷(11)、尿嘧啶(12)、胸腺嘧啶核苷(13)、uridine-5′α-hydroxypropanoate(14)、对甲氧基苯甲醛(15)、对羟基苯甲酸(16)、香草醛(17)、3,4-二羟基苯甲酸(18)、羟基酪醇(19)、3′,5′-二羟基苯基-4-羟基苯甲酸酯(20)、5-羟甲基糠醛(21)。结论 化合物1为新化合物,命名为山荷叶甲酮。化合物20为新的天然产物,并首次对其氢谱和碳谱数据进行归属。化合物2、3、5、6、9~11、13、14、17和19~21为首次从山荷叶属植物中分离得到。首次从该属植物中发现了生物碱类和蒽醌类化合物的存在。DPPH自由基清除实验结果显示,化合物1对DPPH自由基具有较强的清除能力,半数抑制浓度(median inhibition concentration,IC50)值为8.52μmol/L,且强于阳性药水溶性维生素E(trolox,14.95μmol/L)。

青叶胆化学成分的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析

目的运用超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)技术对中药青叶胆Swertia mileensis的主要化学成分进行定性分析。方法采用ACQUITY HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm),用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱,体积流量为0.4 m L/min,质谱使用ESI离子源,正负离子模式下采集数据,运用Masslynx4.1软件并结合Sci Finder数据库、獐牙菜属相关文献以及对照品信息进行数据分析。结果从青叶胆中鉴定出化学成分28个,包括7个环烯醚萜类、14个酮类、3个黄酮类、2个三萜类以及2个酚类。其中断马钱子苷半缩醛内酯、8-O-β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖-1,7-二羟基-3-甲氧基酮、3-氧去甲双酮苷和sweriyunnanlactone A为首次从该植物中发现。结论 UPLC-ESI-Q-TOF-MS技术能够快速准确地鉴定青叶胆中的化学成分,为其质量控制和药效物质基础研究提供一种新的研究策略。

蒙药玉簪花的化学成分研究(Ⅱ)

目的研究蒙药玉簪Hosta plantaginea花的化学成分。方法通过溶剂法与多种现代色谱技术对蒙药玉簪花的化学成分进行提取和系统分离,应用理化鉴别及现代波谱分析技术鉴定化合物的结构。结果从蒙药玉簪花中分离得到12个化合物,分别鉴定为腺嘌呤核苷(1)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、山柰酚-3-O-{β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基}-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、羟基苯甲酸(6)、对羟基苯丙酸(7)、山柰酚-3-O-{β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷}(8)、山柰酚-3-O-{β-D-葡萄糖基-(1→2)-[α-L-鼠李糖基(1→6)]-β-D-葡萄糖苷}(9)、山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、7-甲氧基-山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(11)、熊果酸(12)。结论化合物2～4、9为首次从该种植物中分离得到,化合物1、5～8、10～12为首次从该属植物中分离得到。