人类岩藻糖基转移酶5特异性分布及其在精细胞的表达与定位

目的研究人类岩藻糖基转移酶5(fucosyltransferase 5,FUT5)的特异性分布及在精细胞的表达与定位。方法收集健康志愿者的精液(分离精细胞并提取精细胞膜蛋白)、阴道拭子、唾液及静脉血,应用免疫印迹方法检测FUT5在人类精细胞膜、精浆、阴道液、唾液及血清中的表达量,采用免疫荧光技术检测FUT5在精细胞中的表达与定位。结果免疫印迹方法结果显示FUT5在精细胞膜及血清中有较高表达,但在精浆、阴道液及唾液中未被检测到。免疫荧光实验结果显示FUT5主要存在于精细胞头部。表明人类精细胞膜存在一定表达量的特异性FUT5,可采用抗原-抗体反应分离精液和阴道液混合斑中的精细胞。结论人类FUT5表现出分布特异性,可应用到法医学性犯罪案件中混合斑的鉴定。

Lewis Y寡糖在小鼠胚泡表面的表达受α1,2-岩藻糖基转移酶基因的反馈调控

目的探讨胚泡的LewisY寡糖合成关键酶α1,2岩藻糖基转移酶基因FUT1及α1,3岩藻糖基转移酶基因FUT4的表达和其表面LewisY寡糖抗原表达间的关系。方法以寡糖特异性单克隆抗体封闭体外培养的胚泡表面LewisY抗原,应用RTPCR和间接免疫荧光方法检测胚泡的LewisY寡糖合成关键酶α1,2岩藻糖基转移酶基因FUT1和α1,3岩藻糖基转移酶基因FUT4及其表面LewisY抗原的表达。结果在胚泡表面LewisY寡糖被抗体封闭后,其FUT1的表达迅速升高,FUT4的表达则未见明显变化,而胚泡表面的LewisY寡糖在除去抗体后一直到再培养约21h后才重新出现,在约30h几乎全部复现。结论着床前胚泡表面的LewisY寡糖的表达主要受胚泡α1,2岩藻糖基转移酶FUT1的反馈调节。

α-1,3岩藻糖转移酶各亚型在小鼠胚胎着床前后子宫内膜表达的半定量研究

目的 :研究小鼠胚胎着床前后蜕膜组织α 1,3岩藻糖转移酶 (FucT)III～VII型的表达及其在胚胎着床中的作用。方法 :取未孕和孕 1～ 7d小鼠子宫内膜 ,每组 6例。用RT PCR法测定III～VII型mRNA水平的表达 ,并经测序鉴定。结果 :正常小鼠内膜有一定的FucT IV的表达 ,其表达在妊娠第 1天和胚胎着床前后即妊娠第 4天出现峰值。结论 :5种糖基转移酶中只有FucT IV参与了胚胎着床的过程。它的作用可能是参与了胚泡表面特异性抗原Lex等抗原的糖基化 ,从而促进胚胎的植入。

转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞的活化抑制实验

目的探讨人α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因转移抑制猪动脉内皮细胞(PAEC)Ⅱ型活化的作用和机制。方法用不同条件刺激转人HT基因和正常的PAEC,在不同时段分别采用细胞酶联免疫吸附测定方法检测细胞间黏附分子(ICAM)-1在细胞表面的表达。采用免疫细胞化学方法检测细胞接受刺激12h后2种PAEC核因子(NF)-κB阳性细胞百分数。结果3种刺激均可以活化PAEC,使其表面ICAM-1的表达逐步升高,并在12h左右达到峰值。实验组和对照组细胞在接受刺激4h后ICAM-1的表达差异有统计学意义(P值均<0.05),实验组细胞ICAM-1的表达量均低于对照组,细胞的活化受到抑制。在不同条件下刺激12h后2种细胞的NF-κB阳性细胞百分数差异有统计学意义(P值均<0.05),表达人HT的PAECNF-κB阳性细胞百分数比正常猪动脉内皮细胞低。结论表达人HT的PAECⅡ型活化受到抑制,人HT基因转移可能一定程度抑制异种移植急性血管排斥反应(AVR),并且可能通过NF-κB发挥作用,PAECⅡ型活化的条件是多样的。

携带人α1,2-岩藻苷转移酶基因转基因小鼠的建立

目的:建立携带人α1,2-岩藻苷转移酶[alpha(1,2)-fucosyltransferase,HT]基因的转基因小鼠模型。方法:采用受精卵显微注射法,将人HT转基因构件导入昆明白小鼠受精卵的雄原核内,然后将注射后仍健康的受精卵植入假孕母管内,等其自然分娩。对G0代小鼠,应用聚合酶链反应(PCR)和Southern杂交检测人HT基因的整合情况、应用逆转录PCR(RT-PCR)检测人HT基因mRNA水平的表达,应用流式细胞计数(FCM)检测H抗原及α-Gal抗原在小鼠外周血单核细胞(PBMCs)表面的表达。结果:注射后卵的存活率和幼鼠出生率分别为84.9%(968/1140)和10.8%(105/968),外源基因的整合率为7.6%(8/105),基因整合阳性小鼠中有7只的心、肝、肾及骨骼肌组织均有人HTmRNA表达,并且PBMCs表面H抗原表达阳性,表达强度为人PBMCs的95%～150%,同时α-Gal抗原表达减少,为正常小鼠的5%～10%。转基因小鼠已经稳定传3代。结论:携带人α1,2-岩藻糖苷转移酶基因的转基因小鼠模型已制备成功。

一个类孟买家系的分子遗传学分析

目的探讨一个类孟买家系的分子遗传学机制。方法采用血清学方法鉴定先证者及其父母的红细胞H抗原。采用高保真PCR扩增先证者及其父母的α1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)基因编码区序列。PCR产物经TA克隆后进行测序、比对分析FUT1基因编码区序列。结果凝胶电泳分析证实成功扩增FUT1基因编码区序列;克隆后测序、比对分析发现先证者检出1种已知突变(h1nt547-552△AG),为h1/h1纯合子;先证者父母为H/h1杂合子。结论 FUT1基因突变以常染色体隐性遗传方式导致先证者类孟买血型的形成。

新疆维吾尔族及汉族溃疡性结肠炎患者岩藻糖基转移酶2基因多态性差异初探

目的初步评估新疆维吾尔自治区汉族及维吾尔族UC患者的岩藻糖基转移酶2（FUT2）基因多态性的差异。方法纳入120例UC患者，其中汉族64例，维吾尔族56例，另有320名年龄、性别、民族相匹配的健康对照者。提取所有受试者的DNA，采用PCR扩增并测序，以确定F1，T2基因C357T、A385T、G428A、G739A的多态性，采用卡方检验比较汉族及维吾尔族UC患者与健康对照者的基因频率。结果C357T变异在汉族UC患者中的基因频率为CC0、CT 11．3％、TT88．7％，在相应的健康对照者中为CC5．5％、CT26．1％、TT68．4％（X^2=9．091，P=0．011）。A385T变异在维吾尔族UC患者中的基因频率为AA87．8％、AT8．2％、TT4．0％，在相n应的健康对照者中为AA59．7％、AT33．6％、TT6．7％（X^2=13．480，P=0．010）。G428A变异在汉族UC患者中的基因频率为GG98．1％、AG1．9％、AA0，在相应的健康对照者中为GG83．9％、nAG14．3％、AA1．8％（）[。=7．382，P=0．025）；C-428A变异在维吾尔族UC患者中的基因频率为GG69．4％、AG18．4％、AA12．2％，在相应的健康对照者中为GG35．6％、AG51．0％、AA13．4％。（X^2=18．790，P〈0．01）。G739A变异在汉族及维吾尔族Uc患者与相应的健康对照者中的基因频率差异均无统计学意义（P均〉0．05）。结论FuT2基因多态性与UC相关，其中在汉族人群中C357T、G428A与UC相关，在维吾尔族人群中A385T、G428A与UC相关，表明FuT2基因在新疆地区UC发病中可能起潜在作用。

基于转录组学数据探讨岩藻糖基转移酶Ⅶ在脑胶质瘤中的表达及意义

目的:基于转录组学数据筛选影响脑胶质瘤恶性进展及替莫唑胺耐药的关键基因,分析其在脑胶质瘤中的表达及意义。方法:本研究通过分析GSE23806数据库(63株细胞株)、癌症体细胞突变目录(COSMIC)数据库(34株细胞株)及中国脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)计划数据库(325例患者)中的转录组学数据,分别筛选出在胶质瘤干细胞中高表达的差异基因、在替莫唑胺耐药细胞中高表达的差异基因以及与胶质母细胞瘤恶性预后相关的基因,进而筛选出共同差异基因。通过CGGA与癌症基因组图谱(TCGA)计划数据库(636例患者)验证该基因在不同世界卫生组织(WHO)级别、不同四分型亚型的脑胶质瘤中的表达差异;采用Kaplan-Meier生存曲线比较该基因表达量不同的胶质母细胞瘤患者总生存期的差异;通过单因素和多因素Cox回归分析研究该基因对脑胶质瘤患者总生存期的影响;通过基因本体(GO)功能富集分析及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析预测其潜在的生物学功能。结果:通过分析共同差异基因,筛选出岩藻糖基转移酶Ⅶ(FUT7)作为目标基因。FUT7在胶质瘤干细胞中呈现高表达(P=0.025),且在替莫唑胺耐药的细胞中高表达(P=0.033)。在CGGA数据库(325例)和TCGA数据库(636例)中,FUT7在WHOⅡ、Ⅲ及Ⅳ级组间表达量的差异有统计学意义(均P<0.001),其中Ⅳ级中表达量最高,Ⅱ级中表达量最低;两数据库中,FUT7在四分型组间表达量的差异均有统计学意义(均P<0.001),均在间质型中表达量最高。CGGA数据库和TCGA数据库中具有生存数据的胶质母细胞瘤患者(分别为138例和168例)中,FUT7高表达者比低表达者生存期短(P=0.002和P=0.013);单因素分析结果显示,FUT7的表达量、放疗及化疗均为胶质母细胞瘤患者总生存期的影响因素(均P<0.05);多因素Cox回归分析结果显示,FUT7表达量、放疗及化疗均为影响胶质母细胞瘤患者总生存期的独立危险因素(均P<0.001)。GO功能富集分析显示,FUT7表达量正相关的基因富集在免疫反应、炎性反应、凋亡、趋药性、白细胞迁移及细胞增殖等功能上。KEGG通路富集分析显示,FUT7正相关的基因富集在JAK-STAT信号通路、TNF信号通路及NF-κB信号通路上。结论:FUT7可能是影响脑胶质瘤恶性进展及替莫唑胺耐药的基因,其机制可能与免疫反应、炎性反应、凋亡、趋药性、白细胞迁移及细胞增殖功能,JAK-STAT3和NF-κB等信号通路有关。

核心岩藻糖基转移酶siRNA抑制肾小管上皮细胞转化生长因子β-Smad2／3通路活化

目的探讨α-1，6核心岩藻糖基转移酶（FUT8）小分子干扰RNA（siRNA）对肾小管上皮细胞转化生长因子（TGF）β．Smad2／3信号通路的影响。方法HK．2细胞共分为6组：正常组、阴性对照组、TGF-β1组、TGF-β1加FUT8干扰组、TGF-β1加阴性对照组、FUT8干扰组。利用外源性TGF-β1激活HK-2细胞TGF-β—Smad2／3信号通路。应用siRNA技术沉默FUT8。用免疫荧光方法测定细胞表面核心岩藻糖链表达；用免疫沉淀、凝集素免疫印迹以及免疫双染的方法测定FUT8基因沉默后TGF-αⅡ型受体（TGF-βRⅡ）、TGFα-Ⅰ型受体（ALK-5）的核心岩藻糖基化变化，并检测Smad2／3蛋白表达和磷酸化（P）．Smad2／3蛋白表达及其核转位的变化。结果与正常组及阴性对照组相比，加入5p^g／L的TGF-β1孵育HK-2细胞48h，能显著上调TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白表达水平（P〈0．05），导致p-Smad2／3表达水平明显升高（P〈0．05），并促使其发生核转位。HK-2细胞表面存在核心岩藻糖链表达。与正常组及阴性对照组相比，TGF-β1孵育后，TGF-βRⅡ与ALK-5两种受体的核心岩藻糖链均显著升高（P〈0．05），FUT8siRNA能显著抑制TGF-βRII与ALK-5核心岩藻糖链表达（P〈0．05），从而抑制P—Smad2／3表达升高（P〈0．05）及其核转位，但不影响TGF-βRⅡ和ALK-5的蛋白表达（P〉0．05）。结论在肾小管上皮细胞中，TGF-βRⅡ和ALK-5蛋白翻译后的核心岩藻糖基化修饰是它们发挥生物学功能所需要的，阻止TGF-βRⅡ和ALK-5的核心岩藻糖基化，能抑制TGF-β—Smad2／3信号转导通路的活化。

转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验

目的研究转入α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因克服异种移植超急排斥反应(HAR)的作用。方法构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,体外培养猪动脉内皮细胞(PAEC),脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染PAEC,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,PCR检测重组基因的整合,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原α—Gal表达。分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作对照。将转染细胞和正常细胞分别以20％、40％和60％人血清孵育2 h,比较溶破细胞百分数。结果重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测正常PAEC与转染PAEC,α-Gal平均荧光强度由1346．81降至194．44,H抗原平均荧光强度由9．10增至215．93;α—Gal M2区由99．98％降至37．180A,H抗原M2区由13．80％升至78．54％。转染细胞以人血清孵育后溶破细胞百分数较正常细胞降低,分别由(32．32±2．37)％、(59．54±4．56)％和(71．46±5．94)％降至(15．78±2．69)％、(30．16±1．46)％和(40．48±3．77)％,差异均有统计学意义(P值均<0．05)。结论转人HT基因PAECα—Gal表达明显降低,H抗原表达升高,对人血清溶破的耐受性增强。转人HT基因可以一定程度抑制HAR。

炎症性肠病患者肠黏膜FUT2、FUT3表达的临床研究

背景:岩藻糖基转移酶2(FUT2)、FUT3可特异性催化人类组织血型抗原形成,并与炎症性肠病(IBD)密切相关。然而,关于FUT2、FUT3表达与IBD关系的临床研究鲜见报道。目的:探讨不同临床特征IBD患者肠黏膜FUT2、FUT3的表达变化及其临床意义。方法:连续纳入2019年1月-2020年12月杭州师范大学附属医院初诊IBD活动期患者,收集治疗前结肠镜活检标本,采用免疫组化染色检测FUT2、FUT3表达,分析其表达与疾病临床特征和常用炎症指标的相关性。结果:70例溃疡性结肠炎(UC)、37例克罗恩病(CD)和66例健康体检者纳入研究。CD组FUT2阳性率和相对表达量低于对照组,FUT3阳性率和相对表达量高于对照组,UC组FUT2、FUT3相对表达量高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。FUT2、FUT3表达与IBD患者的疾病严重程度、病变范围/部位、临床表现(腹痛、腹泻、发热、贫血)以及烟酒嗜好均无明显相关性(P均>0.05)。FUT3表达与C反应蛋白、粪便钙卫蛋白水平之间有一定正相关性(r=0.259,P=0.007;r=0.388,P=0.001)。结论:FUT2、FUT3或可成为IBD的辅助诊断和疗效评估指标。

器官移植术

0044280 由纤维蛋白溶解活性抑制过度局部缺血再灌注损伤的减少/Edagawa M//Transplantation.-1999,67(7).-944～949医科情0044281 α-岩藻糖基转移酶类减少人单核细胞粘附和活化的高水准猪内皮细胞表达/Kwiatkowski P//Transplantation.-1999,67(2).-219～226

类孟买血型两例的分子遗传机制研究

目的探讨2例类孟买血型个体的分子遗传机制。方法先证者为女性，在无偿献血时发现ABO血型正反定型不符，遂将其本人及家系成员（包括先证者爷爷、奶奶、父亲、母亲、弟弟、妹妹）血液标本（EDTA抗凝）和唾液标本送至广州血液中心进一步鉴定。采用常规血清学方法对先证者及其家系成员血液标本进行血型鉴定，对唾液标本进行ABH血型物质的检测；利用PCR扩增先证者及家系成员的FUT1和FUT2基因编码区和ABO血型基因第6、7外显子编码区，对PCR产物进行直接测序后分析结果，对FUT1基因的缺失突变进行克隆测序分析。结果先证者及其弟弟为类孟买血型，其他家系成员中未发现类孟买血型；直接测序结果显示先证者和弟弟的FUT1基因为第547—552位碱基AG缺失、880—882位碱基TT缺失的杂合型；其爷爷和父亲为单链880．882位碱基TT缺失杂合型，母亲和妹妹为单链547—552位碱基AG缺失杂合型；克隆测序结果证实上述缺失分别发生在FUT1基因编码区第547-548位和第881—882位；先证者和弟弟的FUT2基因编码区均存在第390位C〉T、第749位G〉A突变，家系成员中还存在第418位A〉T突变。结论FUT1基因不同位点双碱基缺失杂合可导致类孟买血型，单链缺失突变杂合型的ABO表型正常；发现了FUT2基因中3个新的突变位点。

岩藻糖基化修复脐血造血干细胞归巢缺陷研究的新进展

造血干细胞（HSC）植入延迟是脐血移植（UCBT）面临的主要问题，由于植入延迟导致患者移植后感染发生率高，移植相关死亡率增高，限制了UCBT的进行。脐血HSC存在归巢缺陷是造成植入延迟的原因之一。多项研究发现，岩藻糖基化处理能修复脐血HSC的归巢缺陷，并且其操作简便、快捷、安全、有效，对脐血HSC的自我更新与分化能力无损伤，是解决上述难题的可行方法。笔者拟就岩藻糖基化修复脐血造血干细胞归巢缺陷技术的相关研究与临床应用进展进行回顾与展望。

MiR－181a和miR－181b靶向调控FUT1对结直肠癌进展的影响

目的通过研究miR－181a及miR－181b与岩藻糖基转移酶FUT1的相关性，阐明miR－181a和miR－181b靶向调控FUT1在结直肠癌转移中的功能机制。方法收集2014年3月至2016年1月大连医科大学附属第一医院经手术切除的结直肠癌及其癌旁组织共32对组织标本，男性18例，女性14例；采用RT－PCR方法检测了32对结直肠癌患者癌组织、癌旁组织、结直肠癌患者和健康人血清及结直肠癌高转移细胞株SW620、低转移细胞株SW480中miR－181a和miR－181b的表达。通过皮尔森＂Pearson＂相关曲线得出FUT1与miR－181a、miR－181b表达相关趋势。通过生物信息学网站TargetScan、microRNA.org和Starbase v2.0预测及双荧光素酶实验报告验证miR－181a、miR－181b与FUT1的靶向关系；通过CCK8，划痕实验，transwell小室及血管形成进一步检测SW480、SW620细胞中miR－181a和miR－181b表达调控对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭及血管形成的影响。两独立样本间的比较采用t检验，多个样本间的比较采用单因素方差分析，相关分析采用Pearson相关系数分析。结果miR－181a、miR－181b在结直肠癌组织中的表达明显低于癌旁组织（3.12±1.88 vs 6.44±2.32，t＝11.74; 3.16±1.77 vs 5.52±2.45, t＝3.24，P均〈0.05）；miR－181a、miR－181b在结直肠癌患者血清的表达量明显低于健康人血清中的表达量（1.32±0.25，2.57±0.48，t＝10.26；0.91±0.14，1.63±0.29，t＝5.19；P均〈0.05）；在结直肠癌细胞株SW480和SW620中的表达明显低于正常结直肠上皮细胞株FHC[（0.65±0.10、0.50±0.09）vs 1.0, （0.60±0.12、0.42±0.03）vs 1.0; t＝3.08，P均〈0.05]; FUT1在结直肠癌组织及SW620中高表达（t＝5.23，P〈0.05）。TargetScan、microRNA.org和Starbase v2.0软件预测FUT1与miR－181a、miR－181b具有靶向结合位点，双荧光素酶实验验证FUT1为miR－181a、miR－181b的共同靶基因。特异性上调SW620细胞中miR－181a、miR－181b，细胞的增殖、迁移、侵袭、血管形成能力明显降低且FUT1的表达量显著下降。干扰SW480细胞中的miR－181a、miR－181b，细胞的增殖、迁移、侵袭、血管形成能力明显增加且FUT1的表达显著增强。干扰FUT1的表达逆转了miR－181a和miR－181b对SW480细胞侵袭能力的抑制作用。结论miR－181a、miR－181b通过靶向调控FUT1的表达抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭及血管形成。