基于生物信息学分析POFUT1表达与肿瘤免疫浸润水平及患者预后的相关性研究

目的分析蛋白-O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)表达与肿瘤免疫浸润水平及患者预后的关系,探索POFUT1在肿瘤免疫治疗方面的价值。方法基于泛癌数据利用R软件分析各类肿瘤组织中POFUT1表达水平变化及其与各类肿瘤患者风险比的相关性,筛选患者预后与POFUT1表达相关的肿瘤类型;利用String数据库构建蛋白质互作网络,筛选以POFUT1关联基因并进行功能富集分析;利用estimate包分析所筛选肿瘤组织POFUT1表达与免疫浸润评分的相关性;利用TIMER数据库分析肿瘤组织POFUT1表达与各类免疫细胞浸润水平的相关性及免疫细胞浸润水平与患者预后的相关性。结果POFUT1在14类肿瘤中的高水平表达差异具有统计学意义(均P<0.05),与低级别胶质瘤、肺腺癌、甲状腺癌的不良预后相关(Hazard Ratio>1,P<0.05);POFUT1及其关联基因高度参与Notch信号通路、淋巴细胞激活及免疫过程调控进程;POFUT1表达水平与低级别胶质瘤中的B细胞、CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞与树突状细胞、肺腺癌中的中性粒细胞、甲状腺癌中的B细胞、CD4^(+)T细胞及巨噬细胞的浸润程度均呈正相关(|r|>0.2,P<0.05);上述6类免疫细胞高浸润程度均与低级别胶质瘤患者较差的预后相关(Hazard Ratio>1,P<0.05)。结论POFUT1通过对免疫调控相关进程的高度参与,对部分肿瘤免疫浸润水平产生影响并影响患者预后,具有成为免疫治疗靶点的潜力。

α-1,6岩藻糖基转移酶与甲胎蛋白异质体在原发性肝癌诊断中的应用

目的:分析α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)与甲胎蛋白异质体(AFP-L3)在原发性肝癌(PLC)诊断中的应用价值。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测我院92例PLC患者和42例非原发肝癌(NPLC)患者血清中FUT8和AFP-L3。结果:经统计学分析,PLC组与NPLC组血清FUT8和AFP-L3比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:α-1,6岩藻糖基转移酶(FUT8)与甲胎蛋白异质体(AFP-L3)在原发性肝癌(PLC)诊断中有一定的应用价值。

α-1,6岩藻糖基转移酶与肿瘤

由α-1,6岩藻糖基转移酶(α1,6-fucosyltransferase,Fut8)催化的核心岩藻糖基化是糖蛋白重要的翻译后修饰和功能调控方式,直接影响细胞一系列生物学特性,而这种糖基化的异常改变往往是疾病状态的特点。本文就Fut8的表达调控特征、生物学功能及其与各种肿瘤的关系研究进展作一综述。

PARP1通过调控N-糖基转移酶FUT8影响胃癌AGS细胞的增殖与5-FU耐药

目的:探讨聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1(PARP1)对胃癌AGS细胞的增殖和5-FU耐药性的影响及其可能的机制。方法:收集2018年5月至2019年12月于恩施土家族苗族自治州中心医院就诊的72例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织,采用qPCR和免疫组化法检测胃癌和癌旁组织中PARP1的表达状况。CCK-8法、流式细胞术和集落形成实验分别检测PARP1抑制剂AG14361对胃癌AGS细胞增殖、凋亡和集落形成的影响,MTT法检测AG14361对胃癌细胞5-FU敏感性的影响。mRNA测序分析AG14361处理AGS细胞后差异基因整体分布情况,KEGG富集分析相关信号通路。向AGS细胞转染siFUT8以敲减FUT8基因的表达,qPCR和WB法检测AGS细胞内α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的表达状况和敲减FUT8效果,CCK-8法、流式细胞术和集落形成实验分别检测AG14361处理对敲减FUT8表达的AGS细胞增殖、凋亡和集落形成的影响。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中PARP1呈高表达(P<0.001)。AG14361处理可显著抑制AGS细胞的增殖和细胞集落形成,促进AGS细胞凋亡(均P<0.01)。AG14361处理可降低5-FU杀伤胃癌细胞的IC_(50),且在AGS细胞中尤为明显,IC50下降超过60%。m RNA测序结果显示,N-糖基化修饰中FUT8是AG14361抑制AGS细胞增殖的关键糖基转移酶(P<0.05)。与siNC组相比,IC_(50)浓度的AG14361可显著逆转干扰FUT8对AGS细胞增殖的增加,促进细胞凋亡和BAX蛋白表达、抑制Bcl2蛋白表达,抑制FUT8干扰所致AGS细胞集落的增加(均P<0.01)。结论:PARP1可通过调控N-糖基转移酶FUT8促进胃癌细胞恶性转化,其抑制剂AG14361可增强胃癌细胞对5-FU的敏感性,PARP1可能成为胃癌治疗的一个潜在靶标。

蛋白-O-岩藻糖基转移酶1在结直肠癌中的表达及临床意义

目的观察蛋白-O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)在结直肠癌中的表达情况,研究其在结直肠癌早期诊断中的意义。方法通过Oncomine与UALCAN数据库获取TCGA及非TCGA库中POFUT1的基因表达量数据,分析POFUT1在癌症中的表达情况;通过免疫组织化学技术(IHC)检测结直肠癌组织及其对应的癌旁组织与远癌组织中POFUT1的表达情况。结果数据库资料分析结果表明,POFUT1在多种癌症组织尤其是结直肠癌组织中高表达;IHC结果显示,结直肠癌组织中POFUT1的阳性表达率明显高于其对应的癌旁组织与远癌组织。结论POFUT1可能成为结直肠癌早期诊断的新型分子标志物之一。

瘤组织中O-岩藻糖基转移酶1基因表达变化对相关肿瘤预后的影响及其作用机制

目的探讨癌组织中O-岩藻糖基转移酶1基因(POFUT1)的表达变化对相关肿瘤预后的影响及其作用机制。方法结合TCGA数据库及GTEx数据库获取的泛癌数据集,利用GEPIA2及TIMER2数据集,比较多种类型肿瘤与配对的正常组织中POFUT1的表达水平,选出比较有统计学差异的肿瘤类型;比较不同POFUT1水平的上述肿瘤患者的预后。利用TIMER数据库及Estimate软件包筛选POFUT1与免疫细胞浸润水平关联性最强的肿瘤,并分析POFUT1与上述肿瘤组织基质评分、免疫细胞浸润评分及综合评分的相关性。进一步利用String数据库及GE⁃PIA2筛选POFUT1关联基因,并通过DAVID数据库对POFUT1及其关联基因进行信号通路富集分析。结果与配对的正常组织比较,POFUT1在胆管癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、脑低级别胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、胃癌、胃食管癌、甲状腺癌组织中的表达差异具有统计学意义(P均<0.05)。POFUT1在TIMER2和GEPIA数据库中同时均表达差异的肿瘤类型有7种(结肠癌、食管癌、胶质细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、直肠腺癌、胃癌)。肾透明细胞癌和直肠腺癌中,POFUT1高表达组的总生存期高于POFUT1低表达组(P均<0.05);脑低级别胶质瘤、间皮瘤、葡萄膜黑色素瘤中,POFUT1低表达组总生存期高于POFUT1高表达组(P均<0.05)。POFUT1与免疫细胞浸润水平关联性最强的3种肿瘤分别为脑低级别胶质瘤、结肠癌、膀胱尿路上皮癌;POFUT1表达水平与脑低级别胶质瘤组织的基质、免疫细胞浸润、综合评分及结直肠癌组织的免疫细胞浸润评分均具有相关性(P均<0.05)。POFUT1及其关联基因富集的通路主要为蛋白质结合及RNA结合途径、丝氨酸相关酶途径、细胞凋亡通路和Notch信号通路。结论POFUT1在17种肿瘤中表达水平上升;POFUT1高表达的肾透明细胞癌和直肠腺癌预后好,POFUT1低表达的脑低级别胶质瘤、间皮瘤、葡萄膜黑色素瘤预后好;POFUT1可能通过调控肿瘤免疫浸润水平及信号通路如蛋白质结合及RNA结合途径、Notch信号通路等影响肿瘤患者预后。

Lewis y抗原及α1,2-岩藻糖转移酶基因在卵巢癌细胞系中的表达

目的探讨卵巢癌细胞系中Lewisy抗原及α1,2-岩藻糖转移酶(α1,2-FT)基因FUT1表达变化对卵巢癌细胞增殖、耐药和转移的影响。方法采用免疫细胞化学法、免疫细胞荧光法测定α1,2-FT基因FUT1转染前后的人卵巢癌细胞系RMG-I和RMG-I-H、人卵巢癌高转移细胞系HO8910PM及亲本细胞系HO8910、人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP及亲本细胞系COC1中Lewisy抗原的表达。利用RT-PCR法及real-time PCR法检测上述6种细胞中FUT1基因表达的变化。结果经免疫化学方法和免疫细胞荧光法分析,在RMG-I-H、HO8910PM及COC1/DDP细胞系中Lewisy表达强度分别为(53.90±4.33),(37.31±0.19)和(28.52±1.45),与相应的亲本细胞系RMG-I(32.18±0.64)、HO8910(14.96±0.61)及COC1(19.26±0.83)比较均明显升高(P均<0.05)。与RMG-I相比,RMG-I-H中的FUT1基因表达上调3.07倍,与HO8910相比,HO8910PM中的FUT1基因表达上调2.13倍,与COC1相比,COC1/DDP中的α1,2-FT基因表达上调2.42倍(P均<0.05)。结论人卵巢癌细胞表面Lewisy抗原与卵巢癌细胞的增殖、耐药及转移等生物学行为密切相关。

FUT1基因杂合或纯合突变致类孟买血型形成研究

本研究旨在探讨类孟买血型表型形成的分子机制。采用血清学方法鉴定个体红细胞H抗原;采用高保真PCR扩增检测个体的ɑ1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)基因编码区序列,并进行测序、比对分析,以查明个体类孟买血型的发生机制。结果表明:凝胶电泳分析证实成功扩增FUT1基因编码区全长序列;克隆后测序、比对发现:个体1的1条染色体上FUT1基因为h1(547-552delAG),另1条染色体上为h4(35C>T),为h1h4杂合子;个体2,3的2条染色体上FUT1基因均为h1(547-552delAG),为h1h1纯合子。结论:FUT1基因杂合或纯合突变均可致类孟买血型的发生。

中国福建地区类孟买血型个体Fut1基因突变研究

本研究旨在探讨中国福建地区类孟买血型的分子机制。采用血清学方法鉴定研究对象为类孟买血型,采用PCR扩增研究对象的α1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)基因编码区序列,并将PCR产物经TA后进行测序,分析fut1基因编码区序列,以证实类孟买血型的发生机制。结果表明,PCR扩增产物电泳分析证实成功扩增fut1基因编码区序列;克隆后测序分析发现本例先证者2条染色体上fut1基因均为第547-552位AG两碱基缺失(CAGAGAG→CAGAG),导致阅读框架发生移码,提前形成终止密码。结论:本例类孟买血型个体fut1基因为h1h1型纯合突变。

广西巴马小型猪FUT1基因的克隆和序列分析

为了进一步探索α1岩藻糖转移酶(FUT1)基因的遗传效应,试验采用RT-PCR的方法从广西巴马小型猪十二指肠组织中扩增FUT1基因的编码区序列。结果表明:广西巴马小型猪FUT1基因的编码区全长1 098 bp,与GenBank参考序列(登录号为NM_214068)相比,在第380和887位点发生错义突变,分别导致苏氨酸突变为甲硫氨酸,亮氨酸突变为脯氨酸。与普通猪、人、牛及家鼠的同源性分别为99.8%、82.2%、85.2%、77.9%。

POFUT1对人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的抑制作用

目的探讨POFUT1对人胃腺癌裸鼠移植瘤微血管生成的影响及其作用机制。方法制备人胃腺癌BGC823的POFUT1慢病毒低表达及对照组、过表达及对照组细胞模型,分别命名为shRNA-POFUT1-BGC82组、shRNA control-BGC823组、PLV-POFUT1-BGC823组及PLV control-BGC823组。采用皮下成瘤的方法,分别用这4组细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型(每组5只),观察和测算肿瘤体积。30 d后处死裸鼠并取瘤,采用免疫组化方法检测裸鼠瘤组织中VEGF和CD31的表达;Western印迹法检测裸鼠瘤组织中POFUT1和VEGF的表达。结果 20只裸鼠全部成瘤,实验过程无死亡。与PLV control组相比,PLV-POFUT1组裸鼠肿瘤体积显著增加(P<0.05);shRNA-POFUT1较shRNA control组裸鼠肿瘤体积明显偏小(P<0.05)。免疫组化结果显示,与PLV contro1组相比,PLV-POFUT1组瘤组织中VEGF和CD31表达显著增高(P<0.05);与shRNA control组相比,shRNA-POFUT1组则明显降低(P<0.05)。与shRNA control组相比,shRNA-POFUT1组POFUT1和VEGF蛋白表达水平均显著下调;PLV-POFUT1组较PLV contro1组,其POFUT1和VEGF蛋白水平均显著增强(P<0.05)。结论过表达POFUT1可以显著促进裸鼠移植瘤的增殖和肿瘤微血管形成,低表达POFUT1可抑制裸鼠移植瘤的增殖和肿瘤微血管形成,表明POFUT1在人胃腺癌裸鼠移植瘤的微血管形成中起着重要的作用,其机制可能与VEGF密切相关。

免疫球蛋白A肾病患者血清FUT8水平与肾小管间质损伤相关性分析

目的探讨免疫球蛋白A肾病(IgAN)患者血清α1-6-岩藻糖基转移酶(FUT8)水平与肾小管间质损伤的关系。方法选取2020年3月至2022年12月佳木斯大学宏大医院收治的89例IgAN患者作为IgAN组和63例性别和年龄匹配的健康志愿者作为对照组。根据小管萎缩及间质纤维化(T)分级将IgAN组患者分为T0组(28例)、T1组(39例)、T2组(22例),根据间质性炎症指数(Inf I)将患者分为轻度组(0~1分,30例)、中度组(2~3分,42例)、重度组(4分,17例)。检测各组血清FUT8水平,并分析血清FUT8水平与IgAN临床参数、T分级、Inf I的相关性。结果IgAN组收缩压、血肌酐、尿素氮、FUT8水平高于对照组(P<0.05),血清白蛋白和估算肾小球滤过率(eGFR)低于对照组(P<0.05)。不同T分级、间质性炎症细胞浸润程度IgAN患者血清FUT8水平比较差异有统计学意义(P<0.05),T2组血清FUT8水平高于T1组和T0组(P<0.05),重度组血清FUT8水平高于中度组、轻度组(P<0.05)。IgAN患者血清FUT8水平与血肌酐、T分级、Inf I呈正相关(P<0.05),与eGFR呈负相关(P<0.05)。结论IgAN患者血清FUT8水平升高,且与肾小管间质损伤加重、肾功能下降有关。

双碱基缺失型等位基因复合杂合导致的类孟买型个体1例

本研究探索1例类孟买型血型的分子机制,为稀有血型的筛选和鉴定提供理论基础。以血型血清学方法鉴定该个体红细胞的ABO和H表型,利用聚合酶链反应扩增类孟买表型个体的abo基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因(fut1)编码区,并对PCR产物直接测序分析。对纯化的fut1扩增产物进行TOPO克隆和测序,对2处变异位点进行单倍体序列分析。结果表明:血清学分析确认该个体为罕见的类孟买表型;直接测序发现先证者fut1基因第547位和880位附近存在碱基缺失或插入变异;TOPO克隆测序法证实,fut1基因1条单倍体存在第547-552位两碱基AG缺失,另1条单倍体存在880-882位两碱基TT缺失。这2种变异均导致移码突变,并提前形成终止密码。结论:在献血人群中发现1例罕见的类孟买表型,其分子机制为双碱基缺失型fut1等位基因复合杂合所致的α1,2岩藻糖基转移酶活性减弱。

低氧诱导的HIF-1α对结肠癌细胞生长代谢的影响及其调控机制

目的低氧环境下肿瘤细胞生长代谢异常,探讨低氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1,HIF)对岩藻糖基转移酶Ⅳ(fucosyltransferase4,FUT4)的负性调控机制及病理生理意义。方法前期从基因表达数据库中筛选到符合研究条件的芯片GSE77606,结合京都基因与基因组百科全书通路富集分析,发现低氧环境下结肠癌(colon cancer)细胞生长代谢异常,FUT4表达明显下降;随后通过TargetScan数据库筛选出与FUT4信使RNA序列互补的微小RNA(miRNA),并结合定量RT-PCR(QRT-PCR)、荧光素酶报告基因实验及突变实验、短发夹RNA干扰实验和miRNA沉默和过表达实验等探索其具体的调控机制。结果QRT-PCR证实低氧培养HCT-116细胞明显低表达FUT4(P <0.001);TargetScan数据库筛选结合荧光素酶报告基因实验和突变实验证实hsa-miRNA-23a-3p可靶向FUT4信使RNA并下调其表达(P <0.05),同时QRT-PCR显示低氧环境可诱导hsa-miRNA-23a-3p的表达(P <0.05);短发夹RNA干扰实验证实hsa-miRNA-23a-3p的表达受到HIF-1α的正性调控(P <0.01);最后hsa-miRNA-23a-3p沉默或过表达实验进一步证实了hsa-miRNA-23a-3p可正反调控FUT4的表达水平(P <0.001)。结论结肠癌细胞在低氧环境中通过HIF-1α诱导has-miRNA-23a-3p下调FUT4的表达,影响代谢调控,降低细胞侵袭性。

SEC1基因敲除对实验性结肠炎小鼠严重程度和肠道菌群的影响

目的探讨一种小鼠α-(1,2)-岩藻糖基转移酶SEC1基因敲除(SEC1^(-/-))对葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium,DSS)诱导的结肠炎小鼠中结肠炎症和肠道菌群的影响。方法采用CRISPR/Cas9技术构建SEC1^(-/-)C57BL/6小鼠,通过连续口服3%葡聚糖硫酸钠5天构建实验性结肠炎模型,设置SEC1^(-/-)结肠炎组(14只)、野生型结肠炎组(15只)和野生型对照组(6只)共3组。通过疾病活动度评分和体质量变化评估结肠炎严重程度,收集小鼠升结肠内粪便样本,采用高通量16s-rDNA测序技术检测粪便菌群组分,通过生物信息分析比较肠道菌群组分的差异。组间比较采用方差分析、独立样本t检验或秩和检验。结果饮用DSS第7天,与野生型结肠炎组比较,SEC1^(-/-)结肠炎小鼠体质量显著下降(77.9%±4.7%vs 87.0%±6.2%,P<0.05),而疾病活动指数显著升高(7.3±2.8 vs 9.4±2.6,P<0.05)。野生型结肠炎小鼠Simpson指数显著低于对照组小鼠(0.83 vs 0.91,P<0.05),但两组小鼠肠道菌群OTU个数、Shannon和chao1指数比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。与野生型结肠炎组比较,SEC1^(-/-)结肠炎组肠道菌群的OTU个数显著增多(305 vs 194,P<0.05),Shannon和chao1指数均显著增加(4.71 vs 4.09;332 vs 207;P均<0.05),乳酸杆菌属(28.95 vs 2.23)、梭菌属(0.13 vs 0.01)和糖单胞菌属(1.82 vs 0.09)的丰度均显著增多(P均<0.05)。结论SEC1基因敲除使葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型严重程度加重,并影响结肠炎小鼠的肠道菌群组成。

蛋白-O-岩藻糖基转移酶1基因CfPOFUT1在果生炭疽菌中的功能分析

【目的】蛋白-O-岩藻糖基转移酶1(protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)是催化蛋白质O-岩藻糖基化的关键酶,在动物和人体内被证明调控一系列的生理病理过程,然而POFUT1基因在果生炭疽菌乃至真菌中还未见报道。本研究旨在克隆果生炭疽菌中CfPOFUT1基因,并分析其生物学功能。【方法】利用RT-PCR技术扩增CfPOFUT1的基因并进行生物信息学分析,构建了CfPOFUT1基因的沉默和过表达载体,通过PEG介导法将载体导入原生质体中获得CfPOFUT1基因的沉默和过表达突变体。测定了野生型菌株、CfPOFUT1沉默菌株和过表达菌株在PDA上的菌丝生长、分生孢子产生、萌发与附着胞形成、胁迫应答和致病力、杀菌剂敏感性等生物学表型。【结果】与野生型菌株相比,基因过表达突变体产孢量显著增加,致病力增强,对嘧菌酯敏感性降低,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性增强。基因沉默突变体产孢量减少,细胞壁完整性、内质网应激敏感性提高,致病力减弱,对嘧菌酯敏感性提高,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性降低。【结论】CfPOFUT1基因参与调控果生炭疽菌分生孢子产量,细胞壁完整性、内质网对应激和药剂敏感性,并对其致病性也具有一定的影响。

一个类孟买血型家系的α1,2岩藻糖基转移酶基因突变分析

目的 研究1个中国人类孟买型血型家系的分子遗传背景.方法 以血型血清学方法鉴定先证者及其家系的红细胞ABO和H表型,应用聚合酶链反应扩增类孟买表型家系的ABO基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因（α-1,2-fucosyltransferase,FUT1）编码区,PCR产物直接测序分析,并通过克隆测序法对存在FUT1基因复合杂合的样本进行单倍体序列分析.结果 通过血清学技术在9个家系成员中鉴定了3个类孟买型,直接测序发现先证者FUT1基因存在35C/T、235G/C和682A/G复合杂合.单倍体序列分析表明先证者的FUT1基因型为h235c/h35T＋628G.其中h235C等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶G79R替换,h35＋628G等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶A12V和M228V替换.结论 在中国人群中发现一种新的类孟买表型相关的FUT1基因突变235G〉C.

10例类孟买表型α1,2岩藻糖基转移酶基因序列分析

目的:分析10例类孟买血型表型的α1,2岩藻糖基转移酶基因序列情况。方法:ABO、H抗原检测采用血清学方法,利用PCR技术扩增FUT1编码区序列,PCR产物双酶切后直接测序分析。杂合子突变标本采用TOPO TA技术分离得到单链。结果:类孟买血型表型红细胞缺乏H抗原,与抗H试剂不凝集。10例标本直接测定FUT1基因编码区序列,3例为第547-552位AG两碱基缺失(CAGAGAG→CAGAG)纯合子,其它7例为有不同突变点的杂合子。单体型分析显示存在235C、293T、547-552delAG、658T、35T+682G、880-882delTT等6种单体型。结论:类孟买血型存在多种分子遗传机制,最常见单体型为547-552delAG。

α-1，2岩藻糖基转移酶基因293C〉T和658C〉T突变真核细胞稳定表达的研究

目的建立α-1，2岩藻糖基转移酶基因（α-1，2-fucosyltransferase gene，FUT1）293C〉T和658C〉T突变真核表达细胞，阐明FUT1突变引起H抗原减弱的机制。方法抽提类孟买型先证者基因组DNA扩增FUT1全长编码序列，扩增片段与真核表达载体peDNA3．1连接构建重组表达质粒。采用脂质转染技术将重组质粒转染COS7细胞并进行稳定表达筛选。采用实时荧光定量PCR检测mRNA表达量，应用HPLC检测酶活性，采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel eieetrophoresis，SDS-PAGE）和Western印迹技术鉴定蛋白。结果构建了pcDNA3．1-FUT1野生型、pcDNA3．1-FUT1293C〉T、pcDNA3．1-FUT1658C〉T真核表达重组质粒，转染后通过G418筛选获得了稳定表达FUTj的COS7细胞。以野生型重组体转染细胞中FUT1mRNA量作为对照，293C〉T和658C〉T重组体转染细胞FUT1mRNA量分别为野生型的97．10％和104．74％。经SDS—PAGE电泳和Western印迹检测显示细胞表达相对分子质量约46000大小的目的蛋白片段，pcDNA3．1-FUT1野生型重组体转染细胞表达蛋白可催化相应的酶促反应，而peDNA3．1-FUT1293C〉T、pcDNA3．1-FUT1658C〉T转染细胞蛋白完全失去酶活性。结论体外实验提示293C〉T和658C〉T突变并不影响FUT1mRNA转录和蛋白生成，但表达蛋白的酶活性明显下降，从而导致H抗原生成减弱。