崇明拟异小杆线虫daf-16基因的功能鉴定

【目的】昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes,EPNs)的寿命和抗逆性是影响其商品化的重要因素。本研究旨在鉴定崇明拟异小杆线虫Heterorhabditidoides chongmingensis的模式品系DZ0503CMFT(DZ)的DAF-16基因的生物学功能,探讨该基因在DZ线虫的寿命和抗逆性中的作用。【方法】根据DZ线虫和其自身共生菌Serratia nematodiphila DZ0503SBS1~T(S1)及非自身共生菌S.nematodiphila DR186(186)共培养时生长发育的差异,结合已经构建的DZ线虫的数字基因表达谱(digital gene expression profile,DGE)文库,选取调控生长发育的胰岛素/类胰岛素信号通路(insulin/insulin-like growth factor signaling pathway,IIS)的主要转录输出信号DAF-16作为研究对象。通过同源性分析选取daf-16基因中特异性片段作为干扰片段,利用L4440质粒载体构建干扰片段的dsRNA表达载体,并转化到大肠杆菌Escherichia coli HT115(DE3)中。用饲喂法将daf-16dsRNA导入DZ线虫体内沉默基因;利用实时定量PCR检测RNA干扰效果,统计daf-16基因表达下调后的DZ线虫寿命、4个生理阶段的时长、抗逆性(热应激和氧化应激)以及表型(体长)和繁殖性状(48 h内产卵量、卵孵化率和雌虫率)等的变化。【结果】DZ线虫的daf-16 (GenBank登录号:MH101641) cDNA全长2 164 bp,其中开放阅读框(open reading frame,ORF)长1 353 bp,编码450个氨基酸。RNAi后DZ线虫体内的daf-16基因表达量被显著敲低,相对于对照组空载L4440降低了49.05%。RNAi组线虫平均寿命为14.96 d,比空载L4440组(17.60 d)降低了15.00%。DZ线虫daf-16 RNAi组在繁殖阶段和快速身体运动阶段的时长比空载L4440组的短,而快速咽吸阶段和咽抽吸阶段的时长比空载L4440组的长。处理7 d后DZ线虫daf-16 RNAi组在热应激(37℃)和氧化应激(10 mmol/L百草枯水溶液)处理时存活率显著低于DZ线虫的空载L4440组。在产卵量、孵化率、雌虫率和体长上daf-16 RNAi组与对照组之间没有显著差异。【结论】通过RNAi方法初步验证了DZ线虫的daf-16基因的生物学功能,该基因调控了崇明拟异小杆线虫的寿命和抗逆性。

崇明拟异小杆线虫gsa-1基因的功能鉴定

[目的]昆虫病原线虫(entomopathogenic nematode,EPN)的嗅觉趋化性及适应性是影响其在实际应用中的重要因素。本文目的在于鉴定崇明拟异小杆线虫Heterorhabditidoides chongmingensis DZ0503CMFT(DZ)品系中gsa-1基因的生物学功能,探讨该基因对DZ线虫的嗅觉趋化性及适应性的影响。[方法]根据前期构建的DZ线虫与其自身共生菌菌株Serratia nematodephila DZ0503SBS1 T(S1)及其非自身共生菌S.nematodiphila DR186(186)的数字基因表达谱(digital gene expression profile,DGE)文库中的差异基因,选取化感神经元中广泛表达的G蛋白Gα亚基的基因gsa-1作为研究对象。利用饲喂法将gsa-1的dsRNA导入线虫体内进行RNAi,从而降低线虫体内gsa-1基因的表达量。利用荧光定量PCR检测RNA干扰效果,并统计线虫的趋化性、嗅觉适应性、体长、寿命、发育历期及雌虫比例等变化。[结果]DZ/S1单菌侵染期线虫与DZ/186相比其趋化性及适应性均有显著差异。DZ/S1组的线虫对苯甲醛及活体大蜡螟幼虫的趋化性指数分别是DZ/186组的2.99倍和8.62倍。DZ/S1组的线虫对苯甲醛的嗅觉适应性较DZ/186组更强。gsa-1基因在DZ/S1单菌侵染期线虫中的表达量显著下调,相比DZ/186组下降了34.30%。gsa-1 RNAi后,其表达量相比对照组被抑制了54.19%。gsa-1 RNAi组线虫对苯甲醛的趋化性及对活体大蜡螟幼虫的趋化性明显升高,其趋化性指数分别是对照组的4.22倍和2.14倍。gsa-1 RNAi组与对照组之间嗅觉适应性、体长、寿命、发育历期及雌虫比例没有显著差异。[结论]通过RNAi方法初步验证了DZ线虫gsa-1基因的生物学功能,该基因负调控崇明拟异小杆线虫的嗅觉趋化性。

崇明拟异小杆线虫fak基因的功能鉴定

[目的]黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)作为多种信号传导的关键分子,在调节秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的生长发育方面至关重要,直接影响其生存。本研究以小杆科(Rhabditidae)昆虫病原线虫(entomopathogenic nematode,EPN)崇明拟异小杆线虫(Heterorhabditidoides chongmingensis)的模式品系DZ0503CMFT(DZ)为研究对象,鉴定fak的生物学功能,探究其对DZ线虫生长发育的影响。[方法]在DZ线虫数字基因表达谱(digital gene expression profile,DGE)文库中,获取fak基因的编码序列。利用饲喂法将fak的dsRNA导入DZ线虫体内进行RNA干扰(RNA interference,RNAi),从而降低线虫体内fak基因的表达量。利用荧光定量PCR技术检测RNAi效果,对fak RNAi后的线虫进行生长发育分析,检测其在侵染力、体长、寿命、繁殖、生长阶段等方面的差异性。[结果]与L4440对照组线虫相比,fak RNAi组线虫的基因表达水平显著降低,下调39%。同一时间相同浓度的RNAi组线虫对大蜡螟的侵染力较对照组低。RNAi组线虫的平均寿命为16.8 d,比对照组降低21.5%。RNAi组线虫的孵化率为77.9%,比对照组下降15.8%。RNAi组雌虫的体长较对照组短,在培养7 d时为2114.83μm,比对照组下降11.9%。RNAi组线虫在生长的第Ⅰ—Ⅲ阶段所需的时间均较对照组短。与对照组线虫相比,培养12 d的RNAi组线虫对外界的刺激更加敏感。RNAi组与对照组在产卵量和雌虫率方面没有明显差异。[结论]通过RNAi的方法初步验证了fak基因在DZ线虫中的生物学功能,该基因在调控崇明拟异小杆线虫的生长发育方面具有重要作用。