基于rhaSR嵌合操纵子的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

通过PCR等重组DNA技术,构建了含rhaSR启动子表达调控元件、RhaR基因、报告基因gst(谷胱甘肽-S-转移酶)的两个嵌合操纵子,并插入大肠杆菌表达载体pALEX中构成pALEX-PR1和pALEX-PR2。其中pALEX-PR2的RhaR基因上游为原有的SD序列,而pALEX-PR1的RhaR基因上游则插入了增强的SD序列。把这两个重组表达质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中,报告基因gst能够在L-鼠李糖诱导下表达,其表达量是非诱导条件下的4～5倍,且pALEX-PR1的表达量是pALEX-PR2的3.14倍。以上结果表明,gst的表达既受L-鼠李糖诱导,同时又受RhaR的正调控。SDS-PAGE结果显示,GST占大肠杆菌培养物总可溶蛋白的5.41%(W/W),平均1L培养物可获得3.0mg纯化的GST。酶活性分析表明,所构建的嵌合操纵子表达的GST保持了正确的构型且具有很高的活性。

基于rhaSR嵌合操纵子的穿梭表达载体及其在鱼腥藻细胞中表达的初步研究

通过PCR等基因重组技术,以pKT-215(起源于RSF1010)为载体,构建了带有PR序列(含rhaSR操纵子表达调控元件、rhaR基因、报告基因gst的嵌合操纵子)和PT序列(含rhaSR操纵子表达调控元件及rhaT基因)的二种穿梭表达载体pKT-PTR、pKT-PR。其中,在RhaR基因上游设计和插入了增强的SD序列。首先将pKT-PTR、pKT-PR分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同培养基条件下,即含鼠李糖与不含鼠李糖的培养基中进行表达,紫外分光光度计测定GST蛋白(谷胱甘肽-S-转移酶)的活性。结果表明,含嵌合操纵子的穿梭表达载体能在L-鼠李糖的诱导下表达,gst基因的表达量诱导条件下比非诱导条件下高3倍左右,且表达载体上的rhaT基因并不能提高gst的表达;其次,利用三亲结合的方法将2种表达质粒转入鱼腥藻Anabaena sp.PCC7120中,抗生素筛选后得到能稳定遗传的转基因藻,并以转基因藻的质粒DNA为模板进行PCR检测。最后,转基因藻GST酶活力分析结果表明,嵌合操纵子PR在蓝藻细胞中的诱导表达效率极低,表达条件还需进一步优化。尝试将诱导型的操纵子转入蓝藻,具有潜在的应用价值。