嵌合重组caspase-3诱导表达促进肿瘤细胞凋亡

通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞 ,建立了野生型caspase 3(wt casp3) ,大小亚基序列颠倒的重组caspase 3(r casp3) ,和N端融合绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜肽段的嵌合重组caspase 3(cr casp3)的诱导表达细胞系 .蜕皮素诱导后细胞中检测到目的基因的表达 ,MTT检测和细胞计数结果表明 ,r casp3和cr casp3诱导表达后有效地导致HeLa细胞死亡 ,通过测定细胞中caspase 3活性 ,以及细胞周期检测、DNA梯状电泳条带检测(DNAladder)、电镜观察等证实r casp3和cr casp3诱导表达后细胞发生了凋亡 ,且二者的促凋亡活性相当 ,而wt casp3诱导表达细胞并未出现上述效应 .结果表明 ,与野生型caspase 3活化需要上游分子的切割不同 ,重组caspase 3具有自发的促凋亡活性 ,而N端PE肽段的融合不影响这种活性 ,因此PE转膜结构域和重组caspase 3有望参与构建能转膜进入细胞内部 。

丙型肝炎病毒C,E2,NS3区基因嵌合重组载体的构建

【目的】构建包含丙型肝炎病毒 (HCV)C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。【方法】设计合成 3对寡核苷酸引物 ,用PCR法从HCV重组质粒 pHCVc、pBE2和 pGMXNS3 5中特异扩增出编码HCVC区、E2区和NS3区抗原的部分基因片段 ( 5 0 1、6 0 3和 90 0bp) ,分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和 XhoⅠ 酶切后 ,逐个定向连接到质粒 pcDNA3中 ,转化宿主菌XL1 Blue,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。【结果】酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。【结论】成功构建了HCV嵌合重组质粒 pcDNA3 C E2 NS3。

B7-1和新型隐球菌DHA1基因嵌合重组质粒的构建

目的 构建包含新型隐球菌细胞免疫主要相关基因———迟发超敏反应抗原基因 (delayed -typehypersen tivityantigen 1,DHA1)与小鼠共刺激分子B 7-1的嵌合重组质粒。方法 设计合成两对寡核苷酸引物 ,用PCR法分别从pUCmB 7-1TM和新型隐球菌重组质粒pcDNA3 -DHA1中特异扩增出编码B 7-1和DHA1的基因片段 ( 92 1bp和 984bp) ,分别用HindⅢ ,EcoRⅠ ,XbaⅠ酶切后 ,逐个定向连接到质粒pcDNA3中 ,转化宿主菌DH -5α ,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符 ,测序结果与文献报道序列及预计结果一致 ,证实符合表达框架。结论 该研究成功构建了新型隐球菌嵌合重组质粒pcDNA3 -B 7-1-DHA1。

表达鸡传染性喉气管炎病毒gD蛋白的重组嵌合型新城疫病毒La Sota株的构建

为构建表达鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)的重组新城疫病毒(NDV)La Sota株,本研究将ILTV强毒株gD基因胞外域与NDV F基因信号肽、跨膜域和胞质尾区融合,并插入到含有NDV基因VII型F和HN基因的嵌合型La Sota株感染性cDNA克隆pLa Sota-VIIF/HN的P和M基因之间,将获得的重组感染性克隆pLa Sota-VIIF/HN-gD与辅助质粒pCIneo-NP-P-L共转染BHK-21细胞,拯救出表达gD蛋白的重组嵌合型NDV La Sota株rLaSota-VIIF/HN-gD,并采用血凝试验鉴定正确后,将重组病毒在9日龄SPF鸡胚中连续传至10代,提取10代重组病毒基因组RNA,反转录成c DNA作为模板,以ILTV gD基因插入位点两侧的鉴定引物进行PCR鉴定;采用第10代重组病毒感染BHK-21细胞,以ILTV gD蛋白多克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光试验(IFA);分别对鸡红细胞吸附的重组病毒感染的鸡胚尿囊液上清和从红细胞上解离下来的纯化的重组NDV病毒粒子经western blot鉴定,并对重组病毒对鸡胚的致病性和在鸡胚中的复制动态进行初步研究。PCR结果显示ILTV gD基因能够在重组病毒中稳定存在;IFA和western blot鉴定结果显示,重组病毒能够正确表达ILTV的gD蛋白,而且gD蛋白嵌合表达在重组病毒颗粒上。鸡胚致病性试验和鸡胚中的复制动态试验结果显示,重组病毒保持了La Sota疫苗株的低致病性和良好的复制特性,rLaSota-VIIF/HN-gD的鸡胚平均死亡时间(MDT)为168 h,1日龄雏鸡脑内接种该重组病毒的致病指数(ICPI)为0.20,鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值可达10^(-8.66)/100μL。本研究所制备的重组病毒r LaSota-VIIF/HN-gD为研制基因VII型NDV和ILTV的二联活疫苗奠定了基础。

基因工程重组嵌合抗原作为丙型肝炎诊断试剂的应用

利用基因工程重组技术获得了三种嵌合抗原，两种为丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）结构区核壳蛋白Ｃ２２和ＮＳ３非结构区Ｃ３３ｃ双表位的嵌合抗原Ｂ１和Ｂ２，另一种是既具有上述两段优势抗原，还包括ＮＳ４非结构区Ｃ１００多表位的嵌合抗原Ｃ２５。在大肠杆菌水解酶阴性的Ｂ株菌中表达的产物，经ＳＤＳ一ＰＡＧＥ分析，Ｂ１、Ｂ２和Ｃ２５嵌合抗原分子量分别为４３、５３和７０ｋＤ，抗原蛋白表达量分别各占电泳蛋白条带的４０％、１０％和３５％左右。３个嵌合抗原的免疫活性分析证明，它们都具有相应区段的免疫活性。用嵌合抗原分别组装成ＥＩＡ试剂盒，经国家ＨＣＶ诊断试剂质控参比血清验证，Ｂ１嵌合抗原的抗体检出率为９５％Ｂ２嵌合抗原为９１％，Ｃ２５为９４％，均高于Ｃ３３ｃ和ＭＡＰＣＰ１９混合抗原（８８％）。Ｂ１嵌合抗原与核壳蛋白Ｃ区和非结构ＮＳ４区（Ｃ一ＮＳ４）双表位化学嵌合多肽抗原联合应用，抗体检出率高达９７％，完全符合国家ＨＣＶ诊断试剂质控要求。

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组嵌合抗原免疫血清的制备与鉴定

目的制备与鉴定弓形虫棒状体蛋白2(ROP2)和膜表面蛋白1(P30)重组嵌合抗原的特异性免疫兔血清。方法将已构建的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RIL菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,分离上清液和包涵体,包涵体用2mol/L和4mol/L尿素梯度洗涤去杂蛋白,最后用8mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体,进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),割胶回收目的蛋白,研磨成乳浊状后以背部多点注射免疫大白耳兔,制备免疫兔血清,以免疫扩散试验检测生成的特异性抗体,间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析免疫血清的抗体特异性。结果免疫结束后,通过对流免疫扩散试验检测到了针对rROP2-P30的特异性抗体,间接ELISA法测定到其抗体滴度最高可达1∶12800,Western blotting分析结果表明,此免疫血清与可溶性的重组蛋白、包涵体形式的重组蛋白均能特异性结合。结论得到了针对rROP2-P30重组嵌合抗原的特异性免疫血清。

GnRH-PE Ⅱ-luffinS重组嵌合毒素的制备与细胞毒性检测

目的:制备以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRH Ⅰ)为导向部分,以绿脓杆菌外毒素的结构域Ⅱ(PEⅡ)为转膜区,以丝瓜毒素luffinS2为毒性部分的重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS,体外实验检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:重叠PCR法扩增GnRH-PEⅡ-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶(rEK)切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa,A549,HepG-2,SP2/0和鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外细胞毒作用。结果:成功构建了GnRH-PEⅡ-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为94%。GnRH-PEⅡ-luffinS对HeLa,A549,HepG-2和SP2/0的IC50分别为13.50μg/ml,13.74μg/ml,16.79μg/ml和26.07μg/ml,而对CEF无作用。结论:重组嵌合毒素GnRH-PEⅡ-luffinS对肿瘤细胞有较强的杀伤作用。

嵌合猪瘟病毒基因Ⅱ型E2抗原区的重组C株病毒构建及其生物学特性

【目的】目前使用的基因Ⅰ型猪瘟兔化弱毒C株疫苗是公认的安全、有效疫苗,但近年来基因Ⅱ群的猪瘟流行毒株比例增高,因此对猪瘟(CSF)的有效防控提出了更高要求。本研究旨在通过反向遗传学技术构建适应CSFV基因Ⅱ型的新型C株疫苗,为标记疫苗的开发奠定基础。【方法】在构建的C株感染性克隆基础上,拯救嵌合CSFV基因Ⅱ型HZ1-08毒株E2抗原区的重组C株病毒RecCHZE2,并分析其致病性和免疫原性。【结果】重组嵌合病毒RecCHZE2接种家兔后出现典型的定型热,兔脾脏肿大;重组嵌合病毒RecCHZE2接种猪只后没有发热和明显的白细胞减少,在接种后第12天检测到一过性的病毒血症;对接种猪血清检测结果表明,针对2型毒株的相应抗体在接种后的20 d达到高峰;接种猪血清针对C株和HZ1-08毒株的中和抗体效价相当,但C株免疫猪血清对流行毒株的中和抗体水平降低。【结论】重组嵌合病毒RecCHZE2不仅保留C株病毒弱毒的特性,且可提高针对Ⅱ型流行毒株的抗体水平。

细粒棘球绦虫AgB8/1-AgB8/2重组嵌合抗原表达系统的构建

目的构建pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达载体,并对其重组蛋白进行原核细胞表达。方法从细粒棘球绦虫原头蚴中提取总RNA,反转录生成cDNA,以此cDNA为模板,用基因特异性引物分别扩增EgAgB8/1和EgAgB8/2基因编码其分泌型多肽的片段,经测序后,以此两条基因片段为依据,人工合成EgAgB8/1-EgAgB8/2嵌合抗原编码核酸序列,将其克隆至pUCm-T载体,测序鉴定其正确性。通过对pUCm-T/AgB8/1-AgB8/2重组质粒进行双酶切,将获得的AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列用定向克隆技术克隆至原核表达质粒pET32a上,测序鉴定插入片段正确后,转化至E.coliBL21(DE3)Lys S,IPTG初步诱导表达pET32a-AgB8/1-AgB8/2重组嵌合蛋白。用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白的表达水平。结果测序表明,AgB8/1-AgB8/2嵌合抗原编码核酸序列正方向插入至pET32a质粒。SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导后重组嵌合蛋白得到成功表达,在相对分子量约38 kD处有表达条带。结论成功构建了pET32a-AgB8/1-AgB8/2原核表达质粒,并初步诱导表达出AgB8/1-AgB8/2嵌合重组蛋白,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。

Ag43/GFP嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达

目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒p EGFP-C1切取GFP基因序列,首先将Ag43'基因序列插入表达质粒p ET-22b中,获得重组质粒p ETAg43',然后再将GFP基因序列插入p ETAg43'获得质粒p ETAg43'/GFP。将重组质粒p ETAg43'/GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109(△Ag43),用荧光显微镜和SDS-PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43'/GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43'和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒p ETAg43'/GFP经诱导后可以将Ag43'/GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109(△Ag43)的表面,55℃加热50 min是提取Ag43'/GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43'/GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。

注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺的建立及效果验证

旨在建立注射用重组抗肿瘤坏死因子-α人鼠嵌合单克隆抗体病毒去除/灭活工艺,并进行效果验证。膜过滤工艺去除病毒验证结果表明,膜过滤后的蛋白质回收率在98%以上,分子排阻色谱纯度在膜过滤前后没有明显变化;经测试,膜过滤后小鼠白血病病毒、小鼠微小病毒、呼肠孤病毒滴度的降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。低pH值孵放灭活病毒验证工艺结果表明,低pH值孵放前后蛋白质含量、分子排阻色谱纯度没有明显变化;测试结果表明,室温处理时间≥0.5 h,小鼠白血病病毒、伪狂犬病毒的滴度降幅均大于4 lg TCID 50/0.1 mL。该去除/灭活效果均符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求,建立的工艺有效保证了产品的质量及安全性。

基于重组优势多表位抗原的梅毒间接酶联免疫吸附试验与梅毒螺旋体血凝试验和甲苯胺红不加热血清试验检测梅毒螺旋体抗体的比较研究

目的 建立操作简便、特异性好、敏感性高的血清梅毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。方法 通过计算机分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位,构建了梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)表达载体,转化宿主菌HB101进行表达,纯化获得高纯度融合抗原。在此基础上,以纯化抗原包被酶联板,建立检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法。利用该方法与梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)同时检测了126例梅毒可疑血清样本,对检测结果进行了比较研究。结果 梅毒螺旋体多表位优势嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN42-TpN47)在大肠杆菌中获得了高效表达,并成功建立了检测血清中梅毒抗体的间接ELISA法及试剂。对126例梅毒可疑血清样本的检测结果,ELISA、TRUST、TPHA的检出阳性率分别为75.40％(95/126)、72.22％(91/126)、70.63％(89/126),其中TRUST有29例,TPHA有6例为可疑阳性。TPHA检测的6例可疑阳性中,有5例ELISA、TRUST均为阳性;而TRUST测出的29例可疑样品中,仅7例ELISA、TPHA阳性。结论 多表位嵌合抗原ELISA试剂在特异性、敏感性与TPHA法相近,但明显优于TRUST法。

重组嵌合腺病毒35型和重组痘苗病毒SIV疫苗在小鼠体内联合免疫的实验研究

目的研究嵌合腺病毒35型载体和痘苗病毒载体SIVenvT疫苗通过不同策略联合免疫小鼠所诱导的细胞和体液免疫应答。方法通过PCR和Western blot方法对表达SIV mac239株SIVenvT基因的重组嵌合腺病毒35型(rAd5F35-SIVenvT)和重组痘苗病毒安卡拉株(rMVA-SIVenvT)进行体外鉴定。采用两种不同的策略联合免疫BALB/c小鼠,即同源载体免疫和异源载体免疫。通过ELISPOT方法检测小鼠脾脏中分泌SIV Env特异性IFN-γ的淋巴细胞数量,ELISA方法检测血清SIV gp120抗体滴度,比较两种免疫策略诱导小鼠产生细胞和体液免疫应答的差异。结果rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT均能在HEK293细胞中有效表达SIVenvT蛋白。初次免疫后第4周,两组SIV Env特异性细胞免疫应答和SIV gp120抗体均达到峰值,随后呈波动下降趋势。异源免疫组诱导小鼠的应答水平高于同源组,其中第4周和第16周异源组细胞免疫应答强度显著高于同源组,第4周异源组SIV gp120抗体滴度显著高于同源组。结论rAd5F35-SIVenvT和rMVA-SIVenvT两种载体疫苗联合免疫策略能诱导小鼠产生较强细胞和体液免疫应答。

小分子GnRH-luffinS重组嵌合毒素的制备及其细胞毒性检测

目的:制备以小分子丝瓜素(luffin)S2为毒性部分,以Ⅰ型促性腺激素释放激素(GnRH)为导向部分的重组嵌合毒素GnRH-luffinS,体外检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:重叠PCR方法扩增GnRH-luffinS的基因,克隆至表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆诱导表达,产物用Ni-NTA亲和层析柱纯化。纯化蛋白经重组肠激酶(rEK)切割去除Trx融合蛋白,XTT法检测重组毒素对HeLa,A549,HepG-2,SP2/0和鸡胚成纤维细胞(CEF)的体外细胞毒性。结果:成功构建了GnRH-luffinS的表达质粒,并在大肠杆菌中获得表达,纯化后的纯度为93%。GnRH-luffinS对HeLa,A549,HepG-2和SP2/0的IC50分别为67.19,70.42,84.44和106.25μg/ml,而对CEF无作用。结论:重组毒素GnRH-luffinS对肿瘤细胞有一定的杀伤作用。

巴斯德毕赤酵母高密度发酵表达rHC MVp的研究

目的:提高人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp)在巴斯德毕赤酵母中的表达量,并进行发酵罐高密度发酵。方法:将生长培养基的菌体离心后等量接入诱导培养基中(包括不同体积分数的甲醇、pH值)培养,通过菌体密度检测和发酵液上清的SDS -PAGE结果分析不同条件、不同诱导时间对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响,并依据优化条件进行高密度发酵。结果:摇瓶培养时,转化子在体积分数1%的甲醇pH 6 0的条件下诱导72h ,A6 0 0 (菌体密度)为4 5 2 ,目的蛋白表达量达到10 2mg/L。2L发酵罐进行了高密度发酵,经体积分数1%甲醇诱导4 8h ,最终A6 0 0 (菌体密度)达到12 4 ,每升发酵液中含目的蛋白5 7 2 1mg。结论:通过条件优化,进行高密度发酵,获得大量的rHCMVp。

细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原的表达及血清学诊断价值的比较

目的诱导表达并纯化细粒棘球绦虫EgAgB8/1重组抗原和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合抗原,比较两个重组蛋白对囊型包虫病(CE)的血清学诊断价值。方法 IPTG诱导转染至E.coliBL21(DE3)LysS的pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组原核表达质粒,表达和纯化EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白,用SDS-PAGE电泳分析鉴定重组蛋白,并通过超声裂解法进行纯化,以CE病人及囊虫病人血清为一抗,Western blot法检测两个重组蛋白免疫反应性。结果细粒棘球绦虫重组抗原pET32a-EgAgB8/1和pET32a-EgAgB8/1-EgAgB8/2重组原核表达质粒得到成功诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,重组蛋白分子质量单位为28 ku和38 ku;Western blot结果表明,EgAgB8/1重组蛋白和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白均能被CE病人血清特异性识别,16份CE病人血清中,以EgAgB8/1重组蛋白为抗原时11份阳性,以EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白为抗原时13份阳性;用EgAgB8/1和EgAgB8/1-EgAgB8/2重组蛋白检测12份囊虫病人血清,分别有5份和3份阳性。结论 EgAgB8/1-EgAgB8/2重组嵌合蛋白具有抗原特异性,对囊型包虫病的血清学诊断价值优于EgAgB8/1重组蛋白。

表达H9N2亚型禽流感病毒流行株HA基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建与鉴定

为研制同时防控基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)和H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染的新型高效多联疫苗,本研究将上游带有NDV HN基因非编码区(NCR)的H9N2亚型AIV流行株的血凝素基因(HA)插入到含有基因Ⅶ型NDV毒株F和HN基因的嵌合型NDV rLaSota-7F/HN全长基因组cDNA的质粒pNDFL-7F/HN中,构建含有H9N2亚型AIV流行株HA基因的重组NDV全长感染性克隆pNDFL-7F/HN-HA。将pNDFL-7F/HN-HA和辅助质粒共转染至BHK-21拯救出重组病毒rLaSota7-HA。对重组NDV进行了RT-PCR、Western Blot和IFA鉴定,以及生物学特性研究。结果表明,重组NDV rLaSota7-HA可以在鸡胚中稳定传代,且保留了LaSota株在鸡胚中高滴度复制、低致病性等生物学特性。rLaSota7-HA的鸡胚平均致死时间(MDT)为132 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0。鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值达10^(⁃8.78)/100μL,本研究构建的表达H9N2亚型AIV中国流行株HA基因的重组NDV rLaSota7-HA将为研制同时防控基因Ⅶ型NDV和H9N2亚型AIV感染的高效多联疫苗奠定基础。

表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株VP2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建与鉴定

为了研发防控IBDV变异株和基因Ⅶ型NDV感染的高效廉价多联疫苗,将IBDV中国流行变异株的VP2基因共有序列插入到含有基因Ⅶ型NDV毒株F和HN基因的嵌合型NDV LaSota-ⅦF/HN全长基因组cDNA的质粒pNDFL-ⅦF/HN中,构建含有IBDV变异毒株VP2基因的重组NDV全长感染性克隆pNDFL-ⅦF/HN-VP2。将pNDFL-ⅦF/HN-VP2和辅助质粒共转染BHK-21细胞拯救重组NDV rChiLaSota-VP2。利用PCR和Western blot对重组NDV进行鉴定,并对重组病毒的生物学特性进行研究。结果显示,重组NDV rChiLaSota-VP2拯救成功并可以正确表达IBDV VP2蛋白。第25代重组NDV在鸡胚中的生物学特性研究表明,rChiLaSota-VP2保留了LaSota株在鸡胚中高滴度复制、低致病性和遗传稳定性等生物学特性。重组NDV rChiLaSota-VP2的鸡胚半数感染量(EID_(50))峰值可达10^(-8.16)/100μL,鸡胚平均致死时间(MDT)为134 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0。本研究构建的表达IBDV变异株VP2基因的重组NDV rChiLaSota-VP2将为研发同时防控我国流行的基因Ⅶ型NDV及IBDV变异株感染的高效廉价多联疫苗奠定基础。