用RNA/DNA嵌合寡核苷酸进行单碱基突变修正

以含有单个错配碱基的ＲＮＡ／ＤＮＡ嵌合寡核苷酸为载体，通过含ＲＮＡ残基链与靶ＤＮＡ序列的同源配对反应，启动靶细胞内源的错配修复机制，可在特定位点引入或修正单个核苷酸突变，并使修复后的基因表达仍处于原基因调控元件之下。该方法克服了同源重组打靶在哺乳动物细胞的低效问题，为单核苷酸突变所致遗传病或肿瘤的基因治疗提供了新的途径。

嵌合性RNA/DNA寡核苷酸位点特异性修复基因损伤——一种新的单基因病治疗途径

近年来 ,无论是在 RNA或是 DNA水平 ,基因治疗的有关技术方法的研究发展迅速 ,但仍有许多缺陷。最近 ,一种新的用于准确修复基因组 DNA中单个碱基突变或缺失的方法正日趋完善 ,该方法利用同源重组原理 ,使用一段含有 DNA和RNA残基的嵌合寡核苷酸直接修复基因损伤 ,能够在 DNA水平直接转换基因组中的碱基 ,以达到永久性修复遗传性损伤的目的且克服了一些目前存在的缺陷。

RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因修复

本文介绍了RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因修复技术。这一技术是1996年开始发展起来的全新技术 ,它通过人工合成的双链开环RNA/DNA嵌合分子转染细胞而使特定基因靶位点产生单碱基改变 ,从而修复突变基因。这一技术高效 (目前最高可达50 %以上 )、特异性强、安全、无随机插入致变的危险、无免疫反应、无明显毒性 ,能够用于定点突变、基因敲除、动植物功能基因组学、药物遗传学等很多方面的研究 ,在不久的将来能够应用于人类基因治疗 ,具有很高的应用价值和医学前景。

生存素反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞株凋亡的实验研究

背景:生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白家族的成员之一,在肿瘤组织和人类胚胎组织中有高水平表达,在分化成熟的组织中不表达或低水平表达。有研究显示,64.5%～85%的结肠癌组织中存在生存素基因表达,其表达与结肠癌患者的不良预后有关。目的:观察生存素反义寡核苷酸对结肠癌细胞株凋亡的影响。方法:通过基因工程技术构建生存素反义寡核苷酸质粒pcDNA3鄄sur鄄As,以脂质体转染的方法将质粒DNA转入结肠癌细胞株。应用逆转录聚合酶链反应(RT鄄PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测结肠癌细胞株中生存素mRNA和蛋白的表达,流式细胞仪和碘化丙啶(PI)染色检测细胞凋亡,比色测定检测caspase鄄3活性的变化。结果:SW1116、COLO205、HT鄄29和SW1417四株结肠癌细胞株中均有生存素mRNA和蛋白表达。瞬时转染生存素反义寡核苷酸后,4株结肠癌细胞株的细胞凋亡率均明显增加,并呈剂量依赖性(P<0.01);结肠癌细胞株SW1116在荧光显微镜下呈现典型的凋亡细胞形态,细胞中生存素蛋白表达水平明显降低,caspase鄄3活性显著增加(P<0.01)。结论:应用生存素反义寡核苷酸抑制生存素基因的表达能诱导结肠癌细胞株凋亡,以生存素为靶基因的治疗方案可能有助于结肠癌患者的治疗。

植物反义寡核苷酸的研究进展

反义寡核苷酸包括反义RNA、反义DNA和Ribozyme。它能特异地拮抗内源或外源基因的表达 ,这为研究某特定基因功能提供了更为有效的方法 ,为培育抗病植株、调控次生代谢和农艺性状改良提供了可能途径。通过特定的化学修饰 。

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。

人线粒体DNA基因表达谱芯片的制备及鉴定

研制人线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)表达谱芯片,鉴定芯片的特异性和稳定性,完善芯片的制备和使用程序,优化实验参数,为线粒体功能研究提供物质基础及技术保障。以人mt DNA剑桥序列为标准,设计mt DNA编码的13种mRNA、2种rRNA和9种tRNA基因及蛋白产物定位于线粒体的核DNA(n DNA)编码的5种凋亡相关基因寡核苷酸探针。芯片点样仪点制芯片,进行荧光显示和洗脱,用其检测人宫颈癌上皮Hela细胞和人肾小管上皮Hc1细胞c DNA文库mt DNA编码基因及n DNA编码凋亡相关基因的差异表达情况。所点制的芯片扫描结果显示,样点分布均匀、清晰,规整度好,无漏点、连点。c DNA文库杂交鉴定结果显示,整张芯片荧光信号均匀一致,背景清晰,各基因重复样点杂交结果一致,各质控点能正常显示。成功制备了人mt DNA基因表达谱芯片,完善了该芯片的制备和使用程序,通过初步应用,证明所研制的人mt DNA基因表达谱芯片具有特异性高、稳定性好等优点,可用于不同组织或细胞样本c DNA文库mt DNA基因的差异表达分析。

人端粒酶反转录酶反义寡核苷酸对胰腺癌细胞吉西他滨敏感性的影响

目的通过体外实验探讨人端粒酶反转录酶（hTERT）反义寡核苷酸（ASODN）能否增强胰腺癌细胞对吉西他滨（健择）的敏感性。方法采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测hTERTmRNA表达情况；端粒重复序列扩增法（TRAP）、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性；四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖能力；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）双染色法检测早期凋亡。结果瞬时转染hTERTASODN呈浓度依赖性下调细胞hTERTmRNA表达。0．2μmol／LhTERTASODN可显著下调端粒酶活性至0．47。健择在ASODN转染组中的IC50值为（0．8±0．2）μmol／L，而其在单纯脂质体转染对照组中为（7．3±0．9）μmol／L，差异具有统计学意义。ASODN可显著增加健择对肿瘤细胞的凋亡诱导作用，健择诱导的早期凋亡率在ASODN转染组中为60．28％，而其在脂质体对照组中为17．34％。结论hTERT ASODN可增强胰腺癌细胞对健择的敏感性，其机制可能与hTERTmRNA和端粒酶活性下调相关。

人巨细胞病毒感染巨核祖细胞及反义寡核苷酸抗病毒感染作用的研究

目的探讨人巨细胞病毒 (HCMV)对人巨核细胞及其前体细胞的抑制作用及其机制 ,并观察HCMV反义寡核苷酸 (ASON)的抗病毒感染作用。方法在半固体培养基上定向诱导CD34+ 细胞向巨核细胞分化。用HCMVAD16 9病毒株感染培养的巨核细胞和经ASON预处理的CD34+ 细胞 ,观察CFU MK形成率的变化 ,分别用PCR、RT PCR法检测CFU MK细胞中HCMV即刻早期蛋白 (IEP)基因DNA和mRNA、即刻早期基因 (UL36 )mRNA表达。用MTT法测定ASON的细胞毒性。结果CD34+ 细胞在半固体培养基中定向分化为巨核祖细胞。HCMVAD16 9株能明显抑制巨核细胞的体外增殖 ,与灭活病毒组比较 ,三个不同病毒滴度感染组的CFU MK分别减少了 2 1.6 %、33.8%、4 6 .3% ,显示抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系 ;HCMV感染的CFU MK细胞中可检出HCMVIEP基因DNA、IEP基因mRNA和UL36mRNA。 0 .0 8μmol/L的UL36ASON (UL36Anti)能使HCMV感染细胞CFU MK形成率恢复正常 ,与 10 0 0 0TCID50 HCMV感染组比较 (分别为 5 8.2 4± 7.4 2和 31.17± 4 .4 5 ) ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,RT PCR未能检出UL36mRNA。而改变UL36Anti中 1个碱基的ASON(MM1) ,浓度只有达到 0 .4 0 μmol/L才能对抗HCMV的作用。MTT结果表明UL36Anti显著影响细胞生长的浓度为 90 .0 0 μmol/L。

反义技术及其在植物中的应用

反义技术是最近20年来发展的一门全新的基因工程技术,它是从反向遗传学的角度来认识结构基因的功能和基因表达的调控。文中主要综述了反义技术的种类、机制及其在植物领域中的应用。

寡核苷酸介导的基因原位修复

基因原位修复是指一种利用细胞的自身修复机制,定点修复靶基因中突变碱基的策略。目前,基因原位修复在大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞甚至动植物模型都有许多成功例子的报道。近年来,该技术在阐明其机制及提高其修复效率等方面取得了一些进展,但仍然面临着一些挑战,需要更深入地了解其潜力及局限性,使之成为治疗许多遗传性疾病的一种有效的方法。

从转化角度谈表观遗传学与变态反应性疾病

由于表观遗传修饰具有调节环境因素在变态反应性疾病发病或疾病保护方面的作用,最近应用表观遗传修饰研究变态反应性疾病得到了广泛的关注。此外,近期研究证据表明,很多疾病相关细胞的表观基因组发生了改变。尽管目前仍为早期阶段,但是表观遗传修饰,尤其是DNA甲基化和微小RNA (miRNAs)可能具有患者治疗分型和补充甚至替代未来生化或临床检测的潜能。成功免疫治疗相关的表观遗传生物标志物已有第一个报道,即使不考虑个体化治疗方案,表观遗传修饰将在监测甚至预测个体化治疗应答方面扮演重要角色。然而,在表观遗传学应用之前,还需要在表型明确的大规模队列并且特殊的细胞类型进行进一步研究。随着miRNAs类似物、抑制剂和反义寡核苷酸在其他疾病患者中的临床研究,表观遗传组为治疗干预提供了有意义的靶点。尽管需要进一步的技术改进,胞外膜泡和表观遗传编辑的选择和工程改造技术代表着调节细胞表型和应答的新型工具。此外,对宿主表观基因组和微生物组之间相互作用的进一步认识,使通过微生物组干预调节表观基因组预防变态反应性疾病的目标提供了可能性。

Chimeraplasty基因修复技术及其应用

基因治疗是目前生物学和医学领域里的一个研究热点 ,传统的基因替代方法有许多很难克服的缺点 ,与之相比 ,基因修复策略有着明显的优点 .在此 ,文章介绍了近年来发展起来的具有较好应用价值和医学前景的一种基因修复新技术——

用二次电泳法研究核酸与蛋白质的相互作用

研究蛋白质与核酸的结合常遇到的问题是对蛋白质等电点及可溶度等要求较高，或难以同时处理大量标本。为克服此缺点，将待检蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过洗涤去除凝胶中的ＳＤＳ，使蛋白质相对固定于凝胶中，改电泳液为ＴＡＥ或ＴＢＥ，继之用同位素标记寡核苷酸进行二次电泳，通过放射自显影直观地显现出蛋白结合核酸的结果。该法敏感，特异，对蛋白质等电点及可溶性要求低，可同时检测多个样本，值得推广使用。

基因修复方法与治疗

基因修复涉及的对象是基因突变原位校正以恢复正常基因功能。具体基因修复虽然有很多限制,但与扩增技术相比还是有很多优点。本文概述了基因修复的优缺点,主要讨论了基于嵌合RNA/DNA寡核苷酸,单链寡核苷酸和小片段同源替换方法。这些方法都有一些共同点即需要核酸分子到细胞核的有效传递。此外,还有一种新的基因扩增策略—睡美人转座子系统。

用PCR检测犬急性埃里希氏体感染

美国J.W.McBride等人研制了一种可以特异性检测急性感染犬中犬埃里希氏体(E.canis)的PCR测定法。用E.canis 16S核糖体RNA基因区作为PCR扩增的靶并与一个互补内在287碱基对(bp)寡核苷酸探针进行化学发光杂交(CH)。

端粒酶逆转录酶在五羟色胺诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖过程中的作用

目的研究端粒酶逆转录酶(TERT)在五羟色胺(5-HT)诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖过程中的作用。方法组织块法培养大鼠 PASMCs。大鼠 PASMCs 增殖实验分别检测5-HT 和反义 TERT 寡核苷酸对大鼠 PASMCs 增殖的影响。激光共聚焦显微镜检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的反义 TERT 寡核苷酸,明确反义 TERT 寡核苷酸在 PASMCs 中的分布。原位杂交实验和免疫组化实验检测反义 TERT 寡核苷酸和5-HT 对 PASMCs 中 TERT 的 mRNA 和蛋白表达的影响。结果 5-HT 诱导大鼠 PASMCs 增殖实验证实5-HT 在10^(-9)～10^(-5)mol/L 的剂量范围内,5-HT 对大鼠 PASMCs 的促增殖作用具有剂量依赖性。原位杂交实验和免疫组化实验证实5-HT 可能直接或间接促进 TERT 的 mRNA 和蛋白表达。FITC 标记的反义 TERT 寡核苷酸在激光共聚焦显微镜下显示,反义 TERT 寡核苷酸主要分布于 PASMCs 胞质。反义 TERT 寡核苷酸对大鼠 PASMCs 增殖抑制实验证实反义 TERT 寡核苷酸可以抑制5-HT 诱导的大鼠 PASMCs 增殖,而正义 TERT 寡核苷酸对5-HT诱导的大鼠 PASMCs 增殖没有作用。原位杂交实验和免疫组化实验证实反义 TERT 寡核苷酸可以抑制5-HT 引起的 TERT 的 mRNA 和蛋白表达增强。结论研究结果提示,TERT 在5-HT 诱导的PASMCs 增殖过程中发挥重要作用,通过反义技术抑制 TERT 表达为肺动脉高压的基因治疗提供了理论基础。