反向嵌套PCR法高效扩增辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA5′末端序列

采用反向嵌套PCR法 ,根据已获得的辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA的部分序列 ,设计一条 5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物 ,成功地克隆了辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶cDNA 5′末端。与锚定PCR法相比 ,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点 ,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。

反向嵌套PCR技术扩增驯鹿Ghrelin cDNA 5′末端序列

为了研究Ghrelin在驯鹿生长发育过程中的作用和功能,以驯鹿为研究对象,采用反向嵌套PCR RACE技术原理,根据已知的序列设计1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地扩增了驯鹿Ghrelin cDNA 5′末端序列。与锚定PCR相比,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。

半嵌套式PCR技术区别检测犬细小病毒疫苗株和强毒株的研究

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canineparvovirus,CPV)引起的一种多发于幼犬的致死性传染病,主要表现为出血性肠炎和心肌炎[1].在自然条件下本病多呈散发,而在养犬比较集中的地方则常群发[2].

嵌套式PCR超灵敏检测马铃薯环腐病菌

马铃薯种薯中存在环腐病菌潜伏侵染,这种潜伏侵染逐代累积、逐渐表现症状,这是马铃薯环腐病无法根除的根本原因。本研究应用国外成功报道的根据存在于pCS1质粒和环腐菌染色体中一个1.3 kb的插入因子IS1121、高度重复的DNA片段设计的环腐病菌亚种特异性引物序列合成出引物对CMSIF1-CMSIR1和引物对CMSIF2-CMSIR2。以环腐标准菌株、黑龙江省环腐菌株以及马铃薯上其它主要的细菌病原菌(青枯病、软腐病、黑胫病)为试验材料进行直接PCR和嵌套式PCR扩增,结果只有环腐标准菌株和黑龙江省环腐菌株出现特异性片段(直接PCR扩增出1046 bp的片段,嵌套式PCR扩增出864 bp的片段)。将环腐菌纯菌种菌悬液稀释成浓度梯度并与马铃薯组织液混合进行直接PCR和嵌套式PCR检测灵敏度比较,结果表明嵌套式PCR检测灵敏度比直接PCR检测灵敏度提高了100￣1000倍。以明显感病症状的块茎、无明显感病症状的块茎和健康块茎为试验材料进行直接PCR和嵌套式PCR,结果除明显感病症状块茎外,所有无明显感病症状的块茎也均被检测出带有环腐病菌。

半嵌套式PCR检测转几丁质酶基因烟草研究

用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种子和烟苗进行初步筛选鉴定 ,再用 Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基因烟苗中外源转几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式 PCR(Semi- nested PCR)检测转几丁质酶基因烟草植株及其烤后烟叶中的所转目的基因 ;利用限制性内切酶 H ind 对半嵌套式 PCR产物进行酶切 ,从而验证半嵌套式 PCR产物是否为真正的目的基因。研究结果表明 ,半嵌套式 PCR是一种快速。

草莓斑驳病毒分子变异及PCR检测技术研究

【目的】明确草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)的分子变异特点;探索利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的方法。【方法】利用RT-PCR扩增SMoV3′非编码区(non-coding region,NCR)和大外壳蛋白(large coat protein,LCP)基因特异片段,并对扩增产物进行克隆测序。利用生物信息学软件分析不同地区分离物变异特点及系统发育关系。参考测序结果,在SMoV基因组保守区设计引物,利用嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV。【结果】获得了SMoV中国分离物的NCR区和部分LCP基因核酸序列,不同分离物部分LCP基因核酸序列同源性为76.8%～99.7%。系统进化分析显示不同分离物呈现轻微的地理相关性。3个波兰分离物,4个中国分离物中的3个,7个荷兰分离物中的4个分别聚集成一簇;2个德国分离物与其它分离物亲缘关系较远,形成一个独立的分支。建立了利用半嵌套PCR和转录增强技术检测SMoV的技术体系,灵敏度高于常规PCR。【结论】SMoV不同分离物变异复杂,德国分离物可能是一个代表特殊株系的群体;基于定位基因组保守区引物,利用嵌套PCR和转录增强技术可有效检测SMoV。

用嵌套式PCR试验检测IBDV

建立了检测和扩增法氏囊中传染性法氏囊病病毒(IBDV)RNA的快速、敏感设计(草案)。用蛋白酶K消化和随后用酚及氯仿浸出,IBDV RNA从单个囊中得到有效地释放。与传统方法的24小时比较,IBDV RNA浸出时间缩短到4个小时,而且仅需要一个囊而不需要5个囊。这个较简化的程序由于较少的劳动和少用昂贵的化学药品及试剂导致经费支出显著减少。

猴血中SFV病毒基因PCR检测方法的建立及应用

针对猴泡沫病毒SFV(SimianFoamyVirus)多聚酶区 (pol区 )设计两对引物 ,以猴血DNA为模板进行嵌套式PCR扩增 ,得到 5 0 0bp左右基因片段 ,克隆进入pUC 19载体 ,经测序鉴定为SFV 46 5bp的 pol区基因片段。将此段序列与SFV各型 42 5bp的 pol区基因片段进行同源性比较 ,它与SFV 1型的同源性最高 ,为 92 .0 0 %。在此基础上 ,用这两对引物对 15 8例猴血DNA进行检测 ,阳性 5 4例 ,阳性率为 34.2 %。发现在猴群中有较高的SFV病毒的感染。

Development and Clinical Application of a Single-tube Nested PCR Method to Amplify the DNA Polymerase Ⅰ Gene of Treponema Pallidum

Objective: To develop a sensitive, specific and simple method for detection of extremely low numbers of T. pallidum in clinical specimens, as a significant addition to the serologic tests for syphilis diagnosis. Methods: Double-tube nested PCR(DN-PCR) and single-tube nested PCR(SN-PCR) assays were performed to amplify specific fragments of the DNA poly-merase I gene(polA) of T. pallidum. Sensitivity and specificity of the two PCR assays were tested. Eighty-six whole blood specimens from persons with suspected syphilis were detected by the two nested PCR methods. The TPPA test was used as a comparison for detecting syphilis in sera from corresponding patients. Results: Only specific amplicons could be obtained during amplification of the T. pallidum polA gene and the detection limit was approximately 1 organism when analyzed on gel by the two PCR methods. Of 86 clinical specimens, 62 were positive by TPPA. Of these, 54 and 51 were positive by the DN-PCR and SN-PCR, respectively, which does not represent a statistically significant difference between the two PCR tests. Of 24 TPPA-negative specimens, 5 were positive by both DN-PCR assay and SN-PCR assay. Conclusion: The SN- polA PCR method is extremely sensitive, specific and easy to perform for detecting low numbers of T. pallidum in clinical blood specimens as a complementary to serology for syphilis diagnosis.

荧光定量PCR分析弥漫大B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链基因重排表达

背景与目的:大多数B细胞淋巴瘤患者综合治疗后可以达到完全缓解,但是一半以上的患者终究要复发。复发来源于体内残留的耐药淋巴瘤细胞,即微小残留病变。但临床上发现IgH基因重排阳性患者并非都出现复发或远处浸润。因此,推测阳性患者是否复发,可能与IgH基因重排的表达量有关。本研究探讨荧光染料标记的即时定量PCR方法检测弥漫大B细胞淋巴瘤免疫球蛋白重链基因(IgH)重排的可行性及临床意义。方法:44例DLBCL患者的57份新鲜骨髓标本用于检测IgH基因重排,Namalwa细胞系作阳性对照,U-937细胞系作阴性对照。β-actin作内参照,SYBRGreen荧光染料标记的实时荧光定量PCR方法分别检测IgH基因重排CDRIII。结果:分析融解曲线可以确定IgH基因重排产物的特异性。荧光定量PCR检测IgH基因重排的阳性率63.2%。IgH/β-actin阳性表达量在0.01～4131.69,中位数0.42。Ⅰ/Ⅱ期患者IgH基因重排表达量中位数为0,Ⅲ、Ⅳ期患者IgH基因重排表达量中位数为0.35,经统计学检验,两组患者之间差异有显著性(P=0.018)。LDH值高于正常组,IgH基因重排表达量为0.39,LDH值低于正常组,IgH基因重排表达量为0.01,经非参数检验,两组患者之间差异有显著性(P=0.046)。结论:荧光染料标记的定量PCR方法可用于弥漫大B细胞淋巴瘤的骨髓微小残留病变的检测。检测骨髓IgH基因重排,可以协助分期。

用ISSR-抑制-PCR法开发芜菁中的小随体标记

ISSR-抑制-PCR法是小随体的一种简单分离方法，不需要构建基因组文库。实验方法：①用6种限制性酶消化基因组DNA；②把连接物添加到限制片断上；③把小随体基序的10个重复序列和连接物序列作为引物进行PCR；④对产物进行克隆和排序；⑤根据附加序列和排序查明小随体单侧的序列，再利用其单侧序列进行嵌套式PCR；⑥用产物的克隆和排序这种简单而基础性技术进行试验。

中国对虾抗菌肽成熟肽的cDNA克隆

利用RT -PCR、嵌套PCR(NestedPCR)和 3′ -RACE等方法 ,从中国对虾血细胞中克隆到 1种抗菌肽基因片段 ,称为中国对虾肽 (Chp)基因 .此基因片段长 5 4 3bp ,开读框共有 15 6个碱基 ,编码 5 2个氨基酸 .该基因所编码的氨基酸序列对应于凡那对虾抗菌肽成熟肽的序列 ,与其一致性为5 2 - 5 9% ,相似性为 61- 73% ,分子量为 5 65 2 .4Da ,理论等电点为 9.76,带正点荷的氨基酸 (Arg -Lys)为 8个 ,不含带负电荷的氨基酸 .上述这些特征 (分子量较小 ,带正点荷 )均为抗菌肽的普遍特征 .

外来植物紫茎泽兰入侵对菌根菌群落的影响

为了研究紫茎泽兰(Ageratina adenophora)入侵对土壤菌根真菌(mycorrhizal fungi,MF)群落的影响,采用嵌套PCR技术分析了外来植物紫茎泽兰入侵生境内土著植物群落、土著植物与紫茎泽兰混生群落、紫茎泽兰单优群落中,侵染紫茎泽兰及土著植物的MF群落结构,及紫茎泽兰与土著植物根围土壤中MF群落结构。结果表明,紫茎泽兰不同入侵进程MF群落结构存在差异,其中,从土著植物群落的植物根内检测到内养球囊霉(Glomus intraradices)型克隆;从土著植物与紫茎泽兰混生群落的紫茎泽兰根内也检测到内养球囊霉型克隆,而在土著植物根内检测到1个球囊霉属(Glomus sp 2)型克隆;从紫茎泽兰单优群落的紫茎泽兰根内未检测到MF,但从其根围土壤中检测到2个球囊霉属(Glomus sp 1和Glomus sp 2)型克隆。在土著植物与紫茎泽兰混生群落中,从紫茎泽兰根围土壤中检测到4个克隆型,分别为毛舌菌阔孢(Trichoglossum hirsutum)、皂味口磨(Tricholoma saponaceum)、亚盖趋本菌(Xylobolus subpileatus)和翘鳞肉齿菌(Sarcodon imbricatus),从土著植物根围土壤中也检测到4个克隆型,分别为小皮伞(Camarophyllopsis hymenocephala)、肉色香蘑(Lepista irina)、皂味口磨及亚侧耳(Panellus serotinus)型克隆;在土著植物群落中,从根围土壤只检测到皂味口磨型克隆。紫茎泽兰入侵改变了土著MF群落结构,其中在土著植物占据的土壤中以外生菌根真菌为主,而外来植物紫茎泽兰则更多地积累了丛枝菌根真菌。文中讨论了紫茎泽兰改变入侵地土壤菌根菌群落及其可能对紫茎泽兰入侵的反馈。

驯鹿β-防御素reBD-1全长cDNA的克隆及序列分析

为了获得驯鹿β-防御素reBD-1全长cDNA序列,根据已获得的reBD-1cDNA的已知序列设计1条序列特异性引物作为上游引物,反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,克隆reBD-1cDNA的3′末端序列。另外,采用反向嵌套PCRRACE法,根据reBD-1cDNA的已知序列,设计1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,克隆reBD-1cDNA的5′末端序列。结果成功的克隆出了reBD-1cDNA的3′和5′末端序列,从而得到372bp的reBD-1cDNA全序列,其中包含44bp5′非翻译区(UTR)、192bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA、118bp的3′UTR和poly(A)15。reBD-1cDNA全序列的获得为进一步研究其基因结构、基因表达和基因功能奠定了基础。

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因全序列RACE扩增方法的建立

为获得骆驼β-防御素基因(caBD-1 cDNA)的全长序列,采用锚定PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素基因的部分已知序列,设计了1条特异性引物作为上游引物,将反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,成功地克隆了caBD-1 cDNA的3′末端序列;采用反向嵌套PCR RACE技术,根据已获得的骆驼β-防御素cDNA的部分序列,设计了1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地克隆了骆驼β-防御素caBD-1cDNA的5′末端序列。结果显示,获得了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA基因的全序列。证实,RACE技术用于防御素基因的扩增是可行的。

嵌套多重PCR——研究田间植物部分丛枝菌根真菌和微生物区系的一个可行技术

对感染植物根部的丛枝菌根真菌进行准确鉴定是菌根研究的基础,而仅仅通过形态学特征不可能将根内菌根真菌鉴定到种.为了快速、准确而又经济地鉴定植物根内与根际的菌根真菌区系,本研究设计和应用了嵌套多重聚合酶链式反应(PCR)技术.本研究中,首先对所用PCR引物进行了种特异性验证和相容性分析.对4种孢子HAUO3,Glomusintraradices,Scutellosporacastaneae和Glomussp.HAUO4的研究结果表明,嵌套PCR具高度敏感性.在嵌套多重PCR的可行性研究中,应用混合孢子样品,于温室条件下培养得到的4种菌根真菌共感染的紫云英根段,以及于田间采集得到的15种植物的根段.结果证明,嵌套多重PCR反应同样具有高度敏感性,准确率达到95%.同时检测到4种菌根真菌对植物的感染,证明了此实验技术具高度敏感性、高效性,是菌根研究的一种新的简易、经济而又切实可行的方法.

Kas基因启动子区的克隆及功能初步分析

利用TAIL-PCR技术,克隆到了与辣椒素合成有关的胎座特异表达基因———3-酮酯酰-ACP合成酶基因(Kas)上游400 bp的调控区域.将其全长片段与GUS基因连接构建植物表达载体并转化烟草.GUS组织化学染色表明,克隆到的440 bp片段具有启动子活性.对该片段进行序列分析发现,在起始密码子ATG上游存在2个TATA-box,分别为-316^-311位的TATAAA和-224^-219位的TATAAA;在TATA-box上游还存在1个位于-378^-374处的CAAT-box,序列为CCAAT.该研究旨在为利用基因调控辣椒素的生物合成,提高辣椒果实中的辣椒素含量奠定基础.

骆驼β-防御素caBD-1全长cDNA的扩增

获得全长cDNA序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提。我们根据已获得的骆驼β_防御素caBD_1cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列。另外,采用反向嵌套PCRRACE法,根据caBD_1cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β_防御素caBD_1cD NA的5′末端序列。本研究扩增出的caBD_1cDNA序列全322bp,其中包含一个由192bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD_1肽。

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(福建株)基因组的克隆

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一.目前,GenBank已收录了分离自夏威夷、加利福尼亚、泰国、中国台湾等地的IHHNV全长或部分基因组序列.虽然中国大陆在养殖对虾中也普遍检测到了IHHNV,但未见其基因组序列报道.本文首先利用DNA末端加尾和嵌套PCR克隆了IHHNV基因组两末端序列,并根据测定的末端序列设计引物,PCR扩增出中国福建株IHHNV基因组序列.

绰墩山遗址古水稻土的一些微生物学特性研究

在江苏绰墩山遗址考古发掘中，发现了在剖面不同深度埋藏的距今约6500a的史前古水稻田土层（100～200cm）和距今约3320a的商周时期的古水稻田土层（42～100cm）。本研究为了解古水稻土的生物学性状及其与现代水稻土的差别，以土壤剖面P-01（包含史前古水稻土和商周时期古水稻土）与P-03（仅含商周时期古水稻土）为对象，利用土壤厌氧培养、Biolog分析和广古生菌界16SrDNA的V3区的PCR—DGGE分析，初步研究了不同土层厌氧微生物多样性、产甲烷潜势以及产甲烷古菌群落多样性的变化。结果表明，史前古水稻土仍有较多厌氧微生物存活，可达7．0×10^5cfu g^-1干土，并且其单一碳源利用能力和多样性也显著高于其湖相沉积母质和相同时期的非水稻土（黄土母质）。与现代水稻土相比，古水稻土仅存留了很微弱的产甲烷潜势。但史前古水稻土比同期非水稻土和商周时期古水稻土的产甲烷潜势较高。PCR—DGGE结果显示，水稻土层都有其区别于非水稻土层的产甲烷古菌群落结构，而现代水稻土、商周时期古水稻土和史前古水稻土也各有不同的优势产甲烷古菌种群，不同时期的水稻耕作方式是造成这种差异的可能的重要原因之一。