河南省部分猪场猪嵴病毒检测及遗传演化分析

对河南地区猪群中猪峭病毒的分布情况进行分子流行病学调查,从河南省20个猪场中采集共35份腹泻仔猪小肠样品,采用RT-PCR方法对采集的样品进行PKV的检测。结果显示猪嵴病毒阳性检出率为48.57%(17/35),猪场感染率多达70%(14/20);将扩增出来的样品选取6株进行VP1基因测序、同源性对比和遗传进化分析,同源性对比结果表明,分离株的VP1基因核苷酸同源性在81.7%~100%,氨基酸同源性在88.2%~100%,遗传演化分析结果显示,6株分离株均位于已知的全部PKV株构成的4个分支中的Aichi virus C这一个大的分支上。

牛嵴病毒研究进展

牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKV)是小核糖核酸病毒科、嵴病毒属成员的一种无囊膜、单股、正链RNA病毒。该病毒常与其他常见致牛腹泻病毒(牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒等混合感染),是可能导致牛腹泻的病原之一。已经在包括中国在内的世界多个国家和地区检测到该病毒。该文对牛嵴病毒的病原学、流行情况、检测方法等方面的研究进行综述,以期为该病毒今后的研究和防控提供参考。

猪嵴病毒VP0基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测猪嵴病毒(PKV)抗体的间接ELISA检测方法。通过原核表达系统表达PKV VP0基因作为包被抗原,并通过Western blot鉴定证明重组蛋白与PKV阳性血清能发生良好的特异性反应。优化反应条件,得出PKV VP0间接ELISA检测方法最适反应条件是抗原包被浓度为0.62μg/mL,血清稀释浓度为1∶200,最佳酶标二抗稀释浓度1∶5000,使用5%脱脂奶粉作为封闭液37℃孵育1 h,显色10 min,当检测样品OD_(450)<0.225判定血清样品抗体为阴性,OD_(450)≥0.225判定血清样品抗体为阳性,且特异性高、重复性好,与Western blot符合率达到95.6%。PKV VP0蛋白间接ELISA方法的建立,作为一种操作简单,灵敏度高,特异性高,重复性好的血清学检测方法,为PKV的监测和预防提供了技术支持。

嵴病毒的研究进展

嵴病毒(kobuvirus,KoV)是微RNA病毒科的一个新的属,目前,KoV有A型爱知病毒~F型爱知病毒6个种,其均为单股正链RNA病毒。该病毒可通过直接或间接接触方式感染人和多种动物,主要临床症状为腹泻。迄今为止,KoV已经在美国、中国、日本、巴基斯坦、巴西、德国、法国、突尼斯等17个国家检出,具有广泛的地域分布。最近,本实验室的研究表明该病毒在我国山羊和藏绵羊中广泛流行,具有独特的进化趋势,并且有新基因型毒株的出现。本文就KoV的基因组结构及其编码蛋白、流行情况、生物学特性、致病机理、检测技术等方面的研究进展进行综述,以期为后续科学研究以及该病的有效防控提供参考。

牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKoV)的检测方法。【方法】根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针,通过优化反应体系建立牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法,并对临床样品进行检测。【结果】该方法最佳上下游引物浓度均为300nmol·L^(-1),探针浓度为400 nmol·L^(-1),在1×10^(1)~1×10^(8)copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.999,扩增效率为103%;特异性较强,在多个犊牛腹泻相关病原中,只检测出牛嵴病毒;敏感性较高,对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(1)copies·μL^(-1),而普通RT-PCR对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×10^(2)copies·μL^(-1);重复性较好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3~5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%,通过标准曲线计算其病毒载量,其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×10^(5)copies·μL^(-1),健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×10^(3)copies·μL^(-1)。【结论】建立的牛嵴病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高,为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。

2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析

为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3D基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3D基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3D基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3D基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

猪嵴病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果该方法检测PKV的3D基因在6.42×102～6.42×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为(84.94±0.24)℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强。所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%～1.14%,组间变异系数0.63%～1.79%,重复性好。结论本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染水平和确定感染靶器官提供新的检测方法。

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。

牛诺如病毒及牛嵴病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据BNoV和BKoV基因组的保守区域设计2对特异性引物,建立了能同时检测牛诺如病毒(Bovine norovirus,BNo V)和牛嵴病毒(Bovine kobuvirus,BKo V)的双重PCR检测方法。该方法能特异性扩增BNo V和BKo V的目的条带,且未扩增出其他犊牛腹泻病毒性病原;BNoV和BKoV的最低检测限分别为5.39×105 copies/μL和2.23×106 copies/μL;对临床采集的127份犊牛腹泻样品检测结果显示,BNoV的阳性率为6.30%(8/127),BKoV的阳性率为4.72%(6/127),两者与单一PCR检测结果相一致,符合率为100%。本研究建立的双重PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,可用于BNoV和BKoV的快速检测和流行病学调查。

河南地区猪嵴病毒分子检测和VP1基因遗传进化分析

猪嵴病毒（PKV）为新发现的小RNA病毒科嵴病毒属的一个待定种。为调查PKV在河南地区猪群中的感染和流行情况，本研究采集2010年~2012年河南地区84个种猪场150份猪腹泻粪便样品和23份无腹泻症状猪的粪便样品（猪场有腹泻史），采用RT．PCR方法对PKV的VP1基因进行检测。结果显示，检测样品中PKV总阳性率为82．1％（142／173），猪场PKV总阳性率为82．1％（69／84），表明河南地区各种猪群普遍存在PKV感染。其中发病猪群的PKV总阳性率为80．0％（120／150），临床健康猪群的PKV总阳性率为95．7％（22／23），两者无明显差异。此外，对8个阳性样品中VP1基因进行测序比对，结果显示与中国其它地区的PKVvP1基因的核苷酸同源性为80．7％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为83．9％～99．6％。遗传进化分析显示所有已知的PKV株构成4个分支，河南的8个PKV的VP1序列分别位于其中的3个分支中。

猪嵴病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪嵴病毒3 D基因保守序列,设计合成1对引物,以腹泻哺乳仔猪的小肠为起始材料,建立了猪峭病毒的RT-PCR检测方法,并用该方法对收集的50份哺乳仔猪腹泻样本进行检测。结果显示,该方法对模板的最小检测量是2.3pg,检测猪其他常见致腹泻病毒均为阴性,同一样品3次试验结果一致;所扩增的序列经测序分析均为猪嵴病毒的3D核苷酸序列;仔猪腹泻样本的猪嵴病毒检出率达58%。结果表明,该方法敏感度高、重复性和特异性良好,可用于猪嵴病毒的分子流行病学调查和临床病例的快速诊断。

猪嵴病毒和猪星状病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立同时检测猪嵴病毒(PKV)和猪星状病毒(Ast V)的检测方法,本研究根据PKV 3D基因和Ast V ORF2基因设计了两对特异性引物,通过优化反应条件,首次建立了PKV和Ast V双重RT-PCR检测方法。该方法可以同时扩增出PKV的358 bp和Ast V的938 bp特异性片段,而对猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒及大肠杆菌等病原核酸扩增结果均为阴性,具有较强的特异性;对PKV和Ast V的最低检出量分别为1.51×106拷贝/μL和1.19×106拷贝/μL;利用该方法和单项RT-PCR方法对35份来自四川省部分猪场的仔猪腹泻病料样品进行检测。结果显示,PKV和Ast V的阳性检出率分别为80%和31.4%,两者符合率为100%。本研究建立的方法对PKV和Ast V的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的应用价值。

猪嵴病毒PCR检测方法的建立及其应用

本研究根据GenBank上猪嵴病毒核苷酸序列设计了一对特异性引物,建立猪嵴病毒的PCR检测方法。该方法特异性强,敏感度高,重复性好。应用该PCR方法对2010年在上海周边地区采集的116份猪粪样品进行检测,结果45份为猪嵴病毒阳性,表明上海地区猪群中猪嵴病毒相当流行。本研究建立的PCR方法可以用于猪嵴病毒的流行病学监测。

连云港地区规模猪场猪嵴病毒感染流行病学调查研究

为调查猪嵴病毒（PKV）的流行情况,本研究根据PKV 3D基因的保守区设计了一对特异性引物,采用RT-PCR方法对2012年～2013年间从连云港地区64个规模化猪场采集的960份猪肛拭样品进行PKV检测.结果显示：PKV猪场阳性率在50％以上,个体阳性率为15.38％～90.48％;在发生腹泻的猪中PKV阳性率达46.25％,而在非腹泻的猪中阳性率为22.5％;PKV在哺乳仔猪中的阳性率为41.23％,而在育肥猪中的阳性率为22.07％.本研究调查结果为相关疫病的诊断与预防提供了依据.

猪嵴病毒VP0基因的克隆与序列分析

本研究根据猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)VP0基因序列特征设计特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增猪嵴病毒VP0基因全长编码区。将特异性扩增目的片段克隆后进行序列测定,将结果进行拼接后获得猪嵴病毒VP0基因全长并进行相关生物信息学分析。所扩增的目的片段编码有完整的VP0基因开放阅读框,全长为1 098bp,编码有366个氨基酸,理论等电点为6.71,理论分子质量为38.489ku,不稳定系数为34.65,最大疏水指数为2.622,最小疏水指数为-2.122。将获得的VP0基因和GenBank中的猪嵴病毒代表株VP0基因序列进行核苷酸同源性比对和遗传进化分析,其与HNXX-4核苷酸同源性最高,为89.1%,与S-1-HUN核苷酸同源性最低,为81.1%。从遗传进化上看,猪嵴病毒VP0基因在遗传进化上呈两个独立的基因亚群,猪嵴病毒中国分离株在两个遗传基因亚群上均有分布。

猪嵴病毒非结构蛋白2C的生物信息学分析

本研究运用RT-PCR方法从猪嵴病毒感染阳性样品中扩增出其非结构蛋白2C全基因,并将其克隆到T载体后进行序列测定。研究结果表明,猪嵴病毒非结构蛋白2C全长为1005bp,编码335个氨基酸。所编的非结构蛋白2C大小为36.9297ku,理论等电点为7.18;不稳定系数为39.41,属于稳定蛋白质类;脂肪族氨基酸指数为87.10,平均亲水性为-0.242。与其核苷酸同源性最高的是CH/HZ/2011株(GenBank登录号:JX827598),同源性为91.6%;同源性最低的是XX株(GenBank登录号:KC204684),同源性为88.8%。遗传进化分析结果显示,猪嵴病毒非结构蛋白2C在遗传进化树呈3个明显的结构分支,猪源嵴病毒匈牙利株和泰国株处于第Ⅲ遗传进化分支,猪嵴病毒中国分离株分处于第Ⅰ和第Ⅱ遗传进化分支,呈一定的区域流行性。

猪嵴病毒福建株全基因克隆及序列分析

目的为研究猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)福建株的基因组结构特征。材料与方法根据猪嵴病毒基因组特征设计特异性引物,运用RT-PCR方法,对猪嵴病毒福建株进行全基因克隆,并运用RACE方法对猪嵴病毒福建株的5’和3’末端进行扩增。结果与结论所获得的猪嵴病毒福建株基因组全长为8 210bp,其5’末端长度为576bp,3’末端长度为167bp,编码一个大的多聚蛋白,长度为7 467bp,编码2 488个氨基酸。其多聚蛋白核苷酸同源性和我国猪嵴病毒分离株CH/HNXX-4/2012(GenBank登录号JX401523)同源性最高,均为89.2%,和匈牙利猪嵴病毒分离株swine/S-1-HUN/2007/Hungary(GenBank登录号(GenBank登录号EU787450)同源性最低,达87.6%。

猪嵴病毒的特征及检测技术研究进展

嵴病毒是从近年来暴发的仔猪病毒性腹泻疫情中新发现的小RNA病毒科嵴病毒属成员,可引起仔猪的病毒性腹泻。目前对猪嵴病毒的研究刚刚起步,相关报道也比较匮乏。通过对猪嵴病毒的病原学特征及检测技术研究进展作一简要概述,为科研人员加强深入研究及了解仔猪病毒性腹泻疫情的整体概况提供参考。

2014年～2016年山东省猪嵴病毒流行病学调查

为了解猪嵴病毒(PKV)在山东省内的流行情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域设计一对引物,对2014年冬~2016年冬来自山东省350份病料样品进行RT-PCR检测和统计分析。结果显示:在350份病料样品中,PKV阳性率为56%(196/350),阳性猪场占80%(24/30);非腹泻猪个体阳性率(65.38%,153/234)明显高于腹泻猪个体阳性率(37.07%,43/116);育肥猪的PKV阳性率(97.50%)远高于哺乳期仔猪(45.40%)、断奶期仔猪(52.75%)以及成年猪(66.67%);夏秋季节采集的样品PKV检出率(71.94%)明显高于冬春季节(45.50%)。统计PKV与PEDV、TGEV混合感染结果显示,虽然PKV在非腹泻猪群中单独感染率(61.11%,143/234)远高于腹泻猪群(18.97%,22/116),但非腹泻猪群PKV与PEDV和TGEV的混合感染率却明显低于腹泻猪群。对5份PKV阳性样品的3D基因测序分析显示,5份阳性样品该基因核苷酸同源性为90.8%~99.7%,与GenBank中的参考株之间的核苷酸同源性为88.8%~94.1%。上述研究结果表明在山东省范围内PKV感染与猪腹泻之间无必然关系,PKV的3D基因进化与病毒株的分离年代和地域无明显相关性。

猪嵴病毒流行概况及诊断方法的研究进展

近年来,我国仔猪腹泻情况爆发频繁,给我国养猪业造成了严重的经济损失。研究人员在检测病原时发现仔猪腹泻中猪嵴病毒呈现很高的检出率,这引起了兽医研究者的广泛关注。文章根据国内外最新研究资料,首先对猪嵴病毒病原学的研究进展进行了介绍;其次,针对目前猪嵴病毒流行病学概况进行了阐述,对猪嵴病毒流行病学特点进行了讨论;再次,对比猪嵴病毒的几种诊断方法,探讨了各自的优势和不足;最后,展望了猪嵴病毒的未来研究趋势和方向,希望能为猪嵴病毒的进一步研究提供一些有意义的信息。