利用长引物嵌套式反向PCR方法克隆雅致枝霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列

用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ分别对雅致枝霉As3.2806基因组DNA进行消化,而后在低浓度条件下利用T4DNA连接酶使DNA自身环化。根据已知基因序列,设计一对长度为35nt的长反向引物和两对较短的引物,以基因组连接产物为模板,通过三轮嵌套式PCR反应,获得一长度约为4kb的扩增片段。经序列测定表明得到了Δ6-脂肪酸脱氢酶基因上游序列约为1.3kb,初步序列分析显示该序列为一潜在的启动子序列。

富集宏基因组DNA中α淀粉酶全长基因的克隆及重组表达

利用反向-巢式PCR(IN-PCR)从富集土壤宏基因组DNA中克隆到一种α-淀粉酶基因的全序列,其基因登录号为GU045523,测序分析显示与来自Bacillussp.KR-8104耐酸淀粉酶不完整基因同源性为99%。将获得的α-淀粉酶成熟肽基因与表达载体pSE380连接,导入Escherichia coliJM109中,IPTG诱导表达。粗酶液经Ni-NTA、SephacrylS-200纯化后测定酶学性质:重组酶GXAA的最适作用pH为7.0,最适作用温度为75℃,对可溶性淀粉的Km值为11.6g/L。构建突变子E27G、A450T、E27G-A450T,其酶学性质与原始酶没有显著差别。