浙贝母两种主要病害病原菌巢式多重PCR检测方法的建立

浙贝母Fritillaria thunbergii炭疽病与干腐病作为浙贝母上常见的病害,严重影响浙贝母的质量和产量。因此,亟需建立一种快速准确的检测手段,这对病害早期诊断、早发现、早防治具有重要意义。本文以宁波市海曙区章水镇的浙贝母为材料,在前期明确引起上述两种真菌病害的病原菌分别为细线炭疽菌Colletotrichum lineola和尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的基础上,根据ITS序列,分别设计了两对特异性引物FO1-F/FO1-R和BMTJ4-F/BMTJ4-R,建立了针对浙贝母炭疽病与干腐病的巢式多重PCR检测方法。试验结果表明,建立的巢式多重PCR检测体系特异性好,同时检测2种病原菌的灵敏度高达100pg DNA/μL,对10株田间患病的浙贝母植株进行检测,4个样品检测出细线炭疽菌,2个样品检测出尖孢镰刀菌,另有4个样品同时检测出2种病原菌,检出率高达100%,表明该方法可以用于浙贝母炭疽病与干腐病的鉴定,且快速、准确、灵敏,研究结果为浙贝母炭疽病与干腐病的田间检测提供技术支持。

三种内阿米巴原虫巢式多重PCR检测方法

目的:建立能同时检测粪便中溶组织内阿米巴、迪斯帕内阿米巴和莫氏内阿米巴原虫的巢式多重PCR方法;方法:根据溶组织内阿米巴、迪斯帕内阿米巴和莫氏内阿米巴原虫16S rDNA基因序列,设计1对阿米巴属原虫保守引物和3对不同内阿米巴原虫特异性引物,通过反应体系优化及特异性、敏感性等建立了巢式多重PCR方法,并对部分临床样本进行了检测;结果:该巢式多重PCR方法能特异性扩增溶组织内阿米巴、迪斯帕内阿米巴和莫氏内阿米巴原虫目的片段,特异条带大小分别为439、174、553bp,区分明显;该方法可检测粪便样品中阿米巴原虫滋养体的最小值约为20个,在固定其它两种内阿米巴原虫滋养体细胞数量的情况下,该方法最低能分别检测到0.01个E.histolytica、1个E.dispar和0.1个E.moshkovskii滋养体。临床样本的检测也显示巢式多重PCR方法与单一PCR具有较高的一致性。结论:巢式多重PCR方法具有高度的特异性和敏感性,其在溶组织内阿米巴、迪斯帕内阿米巴和莫氏内阿米巴原虫的诊断和流行病学调查中具有重要的应用价值。

运用自动巢式多重PCR系统对儿童重症社区获得性肺炎病原体的检测分析

目的探讨自动巢式多重PCR系统检测儿童重症社区获得性肺炎病原效果,了解佛山地区儿童重症社区获得性肺炎的病原感染情况。方法选取2016年1月至2018年12月入住佛山市第一人民医院PICU的重症社区获得性肺炎患儿,采集鼻咽分泌物,运用自动巢式多重PCR检测腺病毒、冠状病毒(HKUl型、NL63型、229E型、0C43型)、人类偏肺病毒、甲型流感病毒(H1亚型、H1-2009亚型、H3亚型)、乙型流感病毒、副流感病毒(1型、2型、3型、4型)、呼吸道合胞病毒、百日咳杆菌、肺炎衣原体和肺炎支原体。结果自动巢式多重PCR系统检测290份标本中,阳性246份(84.83%)。单一病原阳性样本166份,检出2种病原阳性样本60份,3种病原阳性样本17份,4种病原阳性样本3份。病毒检出阳性病例中,小于6月龄最常见病原为呼吸道合胞病毒(62.39%,73/117);7月龄~1岁最常见病原体为人鼻病毒/肠病毒(3.48%,20/46);1~3岁患儿最常见病原为腺病毒(37.50%,18/48);3~6岁最常见病原为人鼻病毒/肠病毒(35.00%,7/20);大于6岁最常见病原为流感病毒(46.67%,7/15)。腺病毒检出率每年5月份最高,呼吸道合胞病毒检出率8月份最高,流感病毒检出率7月份最高,肺炎支原体及百日咳杆菌感染全年均有散发。结论自动巢式多重PCR系统可高效、快速、准确检测多种病原;不同年龄组重症社区获得性肺炎的常见病原体不同;不同地区因气候不同,常见病原的流行季节不同。

自动巢式多重PCR系统在呼吸道感染病例中快速检测呼吸道病原体的应用

目的探讨自动巢式多重PCR系统在呼吸道感染病原体快速诊断中的应用价值。方法2016年11月至2017年3月收集120例呼吸道感染患者的呼吸道标本和临床流行病学资料，利用自动巢式多重PCR系统对120份鼻咽拭子标本进行病原检测，对检测结果和临床资料进行统计学分析。结果120份标本中单一病原检出68份，2种及2种以上病原混合检出22份，总检出率为75．0％（90／120），检出结果中以甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、百日咳杆菌为主。结论自动巢式多重PCR系统敏感度高、特异性强，对呼吸道感染患者的病原学快速诊断具有重要价值。

芒果炭疽病菌多重巢式PCR检测体系建立及田间快速检测

以芒果炭疽病病原菌rDNA-ITS为靶标,建立并完善多重巢式PCR检测技术,结合常规形态学特征分析,对中国华南地区10个田间样品进行检测分析。结果表明:该技术特异性强、灵敏度达2 fg/μL、重复性强、可操作性强,能同时检测、区分2种病原菌,能够应用于田间炭疽病害的检测工作,也是常规形态学鉴定的补充。利用该技术检测到田间芒果炭疽病存在胶孢、尖孢2种病原菌的复合侵染,该结果为后续开展有效防控措施提供理论指导和技术支撑。

多重巢式PCR应用于1起聚集性发热疫情的病原诊断

目的增强实验室对突发发热疫情的快速诊断能力,完善、优化聚集性发热的病原检测方法。方法采用多重巢式PCR扩增法,对1起聚集性发热疫情样本进行病原筛查,同时对扩增产物测序,进行BLAST比对,进行血清型分型,比较不同引物的扩增效果。结果采集7份病例咽拭子标本,以呼吸道病毒核酸多重联检试剂盒进行14种病毒筛查,其中4份为腺病毒阳性,阳性率为57.1%。采用3组巢式引物进行扩增,腺病毒阳性样本6份,均为腺病毒3型;测序成功的5株核苷酸、蛋白质序列同源性均为100.0%。第3组巢式引物扩增、分析效果较好,阳性率为71.4%。结论成品试剂盒可进行不明原因发热疫情的病原筛查;多重巢式PCR扩增法可增加病毒检出率,对病毒分型和序列分析。

麦冬主要病害病原菌巢式多重PCR检测方法的建立

为准确快速地诊断浙江省慈溪市麦冬常见真菌病害——炭疽病和黑斑病,基于巢式多重PCR技术,针对核糖体内转录间隔区(ITS)序列分别设计特异性引物,并优化巢式多重PCR反应条件,建立可同时快速准确检测炭疽病病原菌山麦冬炭疽菌Colletotrichum liriopes和黑斑病病原菌互隔交链孢菌Alternaria alternata的方法。结果表明,建立的巢式多重PCR检测体系特异性好,同时检测2种病原菌的灵敏度高达100 pg DNA/μL,对10个田间病样进行检测,有5个病样检测到2种病原菌,3个病样检测到其中1种病原菌,2个样品未检测到目标病原菌,验证了该体系的可行性与准确性。表明所建立的巢氏多重PCR技术可用于快速准确检测麦冬2种主要病害的病原菌。

半巢式多重PCR法对A组轮状病毒VP7基因的分型

目的采用半巢式多重PCR法对A组轮状病毒(group A rotavirus,RVA)VP7基因进行分型。方法根据GenBank中RVA VP7基因5′端保守区设计合成多组基因分型引物,提取11个RVA代表流行毒株病毒的RNA,采用半巢式多重PCR方法进行RVA的VP7基因分型,使用BLAST在线软件与GenBank上相应VP7核苷酸序列比对。结果经琼脂糖凝胶电泳鉴定,11株RVA的多重PCR产物大小均与预期一致,能正确鉴别具有代表性的流行毒株VP7基因型[G1、G2、KN105(Wa-like G3)、To16-01(equine-like,DS-1-likeG3)、G4、G8、G9及G12];经BLAST在线软件比对,RVA病毒株VP7基因序列与设计的上游引物匹配,并与下游引物互补,引物特异性良好。结论利用设计的引物成功建立的半巢式多重PCR方法能正确识别RVA的VP7基因型。

多重巢式PCR检测恶性疟和间日疟原虫

目的建立鉴别诊断恶性疟原虫(P.f)和间日疟原虫(P.v)的多重巢式PCR法。方法针对P.f、P.v 18S rRNA基因设计外引物和内引物,优化引物浓度与退火温度,建立可扩增出两种疟原虫基因片段的多重巢式PCR,并检测54例疑似疟疾临床标本,以镜检法为金标准评价敏感性和特异性等指标。结果该方法可扩增出162 bp(P.f)和112 bp(P.v)基因片段,并能检出混合感染。该方法检测P.f,敏感性为87.50%、特异性为63.33%;检测P.v,敏感性为69.23%、特异性为68.29%。结论所建立的多重巢式PCR方法能可靠诊断疟疾并鉴别虫种,敏感性高,在混合感染的诊断方面具有优越性。

阿胶的半巢式-多重PCR鉴别方法研究

采用半巢式-多重PCR(聚合酶链式反应)法鉴别阿胶中是否掺杂有马、猪和牛源性成分。首先采用液氮研磨法从阿胶中提取高质量的DNA(脱氧核糖核酸),以通用引物P1和P2进行第一轮扩增,并将扩增产物作为第二轮PCR的模板;再以包含通用引物P1和4种物种(驴、马、猪和牛)特异性引物A、B、C和D的混合引物进行第二轮多重PCR扩增;最后电泳检测第二轮扩增产物,根据电泳条带的分子量大小,判断阿胶产品的动物原材料是否掺假。结果表明,采用本方法可观察到不同动物DNA分子量之间的明显差异,通过DNA电泳结果直接判断阿胶产品中是否掺假。

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法,对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测,阳性标本数53例,总阳性检测率58.24%;荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例,阳性检出率74.73%;两种方法联合,阳性标本数76例,阳性检出率83.52%。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率,也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。

两种巢式PCR方法在HIV-1早期检测的应用和比较

目的建立并应用HIV-1早期检测的单重巢式PCR和多重巢式PCR方法检测HIV-1感染,探讨两种方法检测结果的差异。方法针对HIV-1主要流行毒株的pol、gag、env 3个基因的保守序列设计巢式PCR引物,建立单重巢式PCR和多重巢式PCR方法。运用两种巢式PCR方法对118例HIV-1阳性样本和48例HIV-1阴性样本进行检测。结果多重巢式PCR方法的灵敏性为96.6%,高于env区单重巢式PCR的80.5%和pol区单重巢式PCR的88.1%(P<0.05),但与gag区单重巢式PCR检测结果(90.7%)差异无统计学意义(P>0.05);多重巢式PCR的特异性为99.2%,高于env区单重巢式PCR的85.4%(P<0.05),但与gag区和pol区的特异性差异无统计学意义(P<0.05);多重巢式PCR方法的平均重复性为98.3%,检测下限至少可以达到250 copy/ml。结论多重巢式PCR检测方法与单重巢式PCR检测方法相比,具有更高的灵敏性、特异性以及较好的重复性,能检测到较低拷贝数的样本,是一种快速、简便、可靠的HIV-1早期检测方法。

FISH联合multiplex RT-PCR检测MLL基因重排的价值探讨

目的:采用荧光原位杂交(FISH)与逆转录多重巢式聚合酶链反应(multiplex RT-PCR)技术检测急性白血病中MLL基因重排的情况,分析两者联合应用的诊断价值。方法:对2008年1月～2011年5月在我院诊断为急性白血病的201例患者采用MLL双色断裂分离重排探针进行FISH检测,同时用multiplex RT-PCR技术检测11种较常见的MLL融合基因,观察MLL基因异常的检出率。所有患者均进行常规染色体核型分析(CCA),观察11q23重排率作为对照。结果:共有19例患者出现11q23/MLL基因重排,在急性髓细胞白血病(AML)中的检出13例(10.2%),急性淋巴细胞白血病(ALL)的检出6例(8.2%)。FISH联合multiplex RT-PCR对MLL基因重排的检出率为9.45%,CCA对11q23异常的检出率为5.47%。5例正常核型的患者和3例未涉及11号染色体异常的患者中FISH检出了1例MLL倒位和3例扩增信号,multiplex RT-PCR检出了7例dup MLL(11q23)重排。结论:FISH联合multiplex RT-PCR能提高MLL基因重排检出率。

4种病原菌“单管一步法”PCR快速检测方法的建立

为了检测实验动物常见的4种条件性致病菌:肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺巴斯德杆菌和绿脓杆菌,提出一种可更准确、灵敏、快速、简便的多重巢式PCR方法(MN-PCR)。根据待检微生物16S rDNA序列的保守区和可变区分别设计通用引物和特异引物,通过两种引物长短差异化创新设计,将模板富集和特异片段扩增两个过程整合为单个反应体系内的一步PCR反应。结果表明,MN-PCR方法能够在标准株DNA混合模板中同时扩增出4条待检测片段;而在阴性对照组中未检测出任何片段。MN-PCR方法在实际检测应用中能够成功检测出细菌感染阳性样本,且未扩增出其他微生物的特异性条带。建立的MN-PCR体系可以同时检测实验动物咽拭子等临床样本中的多种病原菌,与常规多重PCR方法相比,该方法具有特异性和灵敏度高、操作简便、节省时间等优点。

使用多重巢式PCR对我国HIV-1主要流行株亚型鉴定方法的建立

目的 建立一套新的亚型鉴定方法 ,仅仅使用巢式PCR ,一次扩增 ,即可对我国HIV 1主要流行株B、C和CRF0 1 AE进行亚型鉴定。方法 从HIV阳性样本中提取核酸 ,使用能覆盖HIV 1型M组gag区的引物进行第一轮扩增 ,第二轮扩增则使用分别检测B、C、CRF0 1 AE亚型的三套特异性引物进行扩增 ,三套引物放在同一个反应管中。反应产物经琼脂糖电泳后观察 ,不同亚型的位置不同 ,以此来判断亚型。另外设计一套引物 ,专门检测我国重组株CRF0 7 BC和CRF0 8 BC。所有样品均经过基因测序、系统进化树分析 ,以进行结果验证。结果 在检测的 119份样品中 ,经基因测序和系统进化树分析证实B亚型样品 4 3份 (欧美B 11份 ,泰国B 32份 ) ,C、CRF0 1 AE、A和D亚型样品分别为 5 4份、17份、3份和 2份。其中C亚型的样品 ,有 5 2份属于CRF0 7 BC和CRF0 8 BC。而经过上述多重巢式PCR方法检测到的B亚型样品为 35份 (81 4 % ) ,C亚型 4 6份 (85 2 % )和CRF0 1 AE 13份(76 5 % )。另外 ,检测CRF0 7 BC和CRF0 8 BC重组株的引物特异性地检测到 4 3份 (82 7% )样品。上述结果与基因分析结果吻合 ,各个亚型之间无交叉 ,一种亚型的特异性引物只对该亚型有反应 ,而对其他亚型无反应 ,特异性达到 10 0 %。虽然有时会有非特异扩增带 。

肺炎链球菌多重巢式荧光PCR分型方法的建立和应用

目的建立一种敏感且节省标本的多重巢式荧光PCR方法,用于临床标本中肺炎链球菌的分型。方法以检测肺炎链球菌种属(lytA基因)和20组常见血清型的引物和探针为基础,分别采用92株不同血清型的肺炎链球菌菌株和系列稀释的参考DNA模板,建立多重巢式荧光PCR方法。评价该方法的特异性和敏感性,同时与荧光PCR方法进行比较。将该方法用于14份肺炎链球菌培养阳性和30份肺炎链球菌培养阴性的临床标本的检测,评价实际应用效果。结果多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法能准确鉴定/区分大部分菌株(90/92)的血清型。前者的检测灵敏度为1~100 fg/μl,9种血清型的灵敏度高于荧光PCR方法(10~100 fg/μl)。44份临床标本中,多重巢式荧光PCR与荧光PCR方法分别检测出34和31份阳性(P=0.778),2种方法的DNA模板使用量分别为15μl和66μl。结论多重巢式荧光PCR比荧光PCR方法节省标本且更加灵敏。

急性呼吸系统疾病暴发疫情多重巢式PCR检测分析

目的对3起不明原因的聚集性急性呼吸系统疾病暴发疫情的标本进行多重巢式PCR检测,及时筛查SARS病毒、高致病性人禽流感H5N1亚型病毒并检测其他亚型流感病毒、副流感病毒、支原体、肺炎衣原体等病原体,探讨该方法在聚集性急性呼吸系统疾病调查中的应用意义。方法采用多重巢式PCR方法对3起疫情的咽拭标本进行可引起急性呼吸系统疾病的23种病原体进行筛查。结果医院甲不明原因肺炎聚集性病例9例,对9例咽拭标本进行筛查,肺炎衣原体感染6例;学校乙不明原因肺炎聚集性病例69例,对13份咽拭标本进行检测,B型流感嗜血杆菌(HIB)感染7例;学校丙不明原因肺炎聚集性病例12例,对12份咽拭标本进行检测,HIB感染5例。结论多重巢式PCR方法可快速有效地筛查引起聚集性急性呼吸系统疾病暴发疫情的病原体,为有效遏制疫情及进一步处理提供线索。

三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。

马传染性贫血病毒美洲流行株与我国弱毒疫苗株鉴别诊断方法的研究

In order to develop an assay to distinguish the infection of Equine infectious anemia virus(EIAV)American strains from Donkey-leukocyte attenuated virus(DLV)strain,eight primers were designed based on the comparison of complete sequences of four EIAV American strains and DLV.Corresponding viral genome fragments were amplified and analyzed from donkey leucocytes by PCR using these eight primers.Four primers from gag gene were selected to detect the differences between EIAV American strains and DLV.Six horses were inoculated with DLV and two with EIAV American strains,the Wyoming strain and the Argentina strain,respectively.Two fragments,675bp and 400bp,were amplified from DLV-infected cells,while only one segment of 675bp was obtained from cells inoculated with American strains.Our results indicate that this nest multiplex PCR can be used to distinguish EIAV American strains from the donkey leucocyte-attenuated vaccine strain of EIAV.

儿童肺泡灌洗液肺炎支原体检出率及基因型分析

目的:检测136例儿童肺泡灌洗液标本感染肺炎支原体(MP)的情况并初步了解安徽合肥地区MP基因型情况。方法:采用普通PCR技术从136例儿童的肺泡灌洗液标本筛查出已感染MP的标本,并通过巢式多重PCR技术对MP阳性标本进行基因型分析,对照试验采用FH-MP标准株为DNA模版。巢式多重PCR扩增后的DNA片段构建T载体重组质粒做基因测序验证。结果:普通PCR检测显示有52例MP阳性标本(136例肺泡灌洗液标本)。巢式多重PCR技术检测显示MP阳性标本基因型均为P1-Ⅰ型,而标准株FH-MP的基因型为P1-Ⅱ型。重组质粒经过测序后进行片段对比验证其扩增条带均正确。结论:合肥地区儿童MP流行株基因型为P1-Ⅰ型,感染MP的阳性率为38.2%。