人外周血IL-12 P35 cDNA的巢式PCR扩增、克隆与测序

目的 克隆中国汉族人IL -12P3 5cDNA序列 ,并进行序列测定。 方法 利用反转录巢式PCR从健康人外周血总RNA中扩增IL -12P3 5cDNA序列 ,插入T载体PMD -T中 ,重组质粒转化大肠杆菌JM10 9,所获克隆经PCR初筛后进行酶切鉴定 ,阳性克隆进行DNA测序。 结果 从健康人外周血总RNA中扩增出约 670bp条带 ,与预期大小相同 ,PCR与酶切鉴定证明得到PMD/P3 5阳性克隆 ,DNA测序证实了插入片段的正确性。 结论 在体外成功的扩增、克隆了中国汉族人IL -12P3 5cDNA序列。为继续开展IL -12的基础与应用研究奠定了基础。

重组酶聚合酶扩增结合Cas12a输血相关病原体核酸检测方法的可行性

目的探讨重组酶聚合酶扩增(RPA)结合Cas12a检测输血相关病原体的可行性。方法 1)根据输血相关病原体HIV、HBV、HCV基因组保守区设计、筛选相应Cas12a crRNA。2)据crRNA靶序列区叠瓦状设计RPA巢式扩增内、外侧引物,凝胶电泳法和荧光探针法筛选巢式RPA内、外侧引物。3)通过质粒或病毒模拟标本梯度稀释,将含不同拷贝数或含量的靶序列RPA扩增,扩增产物以Cas12a检测评价RPA结合Cas12a的检测下限。4)用HIV、HBV、HCV相应近源病毒HTLV、WMHBV、HGBV的同源序列的重组质粒来评价所选crRNA的特异性。结果建立起RPA结合Cas12a核酸检测系统,16份重组质粒的检测下限为10 cp,8份EcoHIV病毒模拟标本的检测下限为1 fg,HIV、HBV、HCV 3种重组质粒及RPA扩增产物的交叉检测间未出现错误检出;10例HIV阳性确证标本的检测结果均为阳性。结论 RPA结合Cas12a检测HIV、HBV、HCV核酸是1种检出限和特异性均较好的核酸检测方法。

煤绒菌(Fuligo sp.)DNA提取方法的研究及用于扩增EF1A基因片段的引物设计

采用氯化苄法提取煤绒菌的基因组DNA,并成功获得PCR产物。同时采用Primer 5.0软件设计得到延长因子EF1A特异性引物EF243、ER824和ER1001,用这些引物对煤绒菌的延长因子EF1A基因进行半巢式PCR扩增获得成功。

细胞系中支原体检测及分型

目的:对细胞系中支原体的感染情况进行检测并分型。方法:利用支原体 16S^23S保守区域扩增来检出细胞系中支原体感染率,并利用 16S^23S保守区间的间隔区(spacer)长度不同进行巢式PCR扩增,结合测序达到分型的目的。结果:在检测的 22株细胞系中,有 77. 3% (17株)的细胞系有支原体感染,其中 5株有 2种或 2种以上支原体感染,在分布上以M.fermentans和M.hyorhinis支原体多见。结论:支原体在细胞系中的高感染率提示,在以细胞系作为模型的研究中,对支原体感染所造成的影响应有充分认识。检测及分型技术的建立为进一步研究不同型别支原体的致病力提供了可能。

先天性脊柱骨骺发育不良的产前快速分子诊断

目的:对先天性脊柱骨骺发育不良提供1种快速分子产前诊断技术。方法:对该患者于孕14周进行羊膜囊穿刺,获取羊水20 ml,提取羊水细胞基因组DNA。选用3个短串连重复(STR)序列位点,进行荧光PCR检测,以排除母源细胞污染。在此基础上,对COL2A1基因的第23外显子进行扩增,并以此为模板,针对COL2A1基因的第23外显子1510G→A的突变进行SSP-PCR。根据是否存在特异性的扩增条带进行判断,对初次扩增的产物测序,以证实巢式SSP-PCR的结果。结果:对D13S 317、D18S51和D21S11位点的STR检测结果排除母源细胞的污染。羊水样本仅在野生型反应管中有扩增产物,表明胎儿是COL2A1基因的第23外显子1510 G的纯合子,未带COL2A1基因的第23外显子1510G→A的突变。测序结果与SSP-PCR结果一致。结论:SSP-PCR技术快速简便、敏感特异,可作为该突变的快速分子诊断。其他已知点突变遗传病的快速分子诊断也可以考虑使用SSP-PCR技术进行。

肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶基因甲基化研究

目的:研究肝癌细胞中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)甲基化的改变。方法:纯化人肝癌及癌旁组织中总GGT及RNA,观察总GGT、膜结合和可溶性GGT的表达,并以逆转录巢式PCR扩增GGT非编码区基因片段,分析M_3位点的甲基化状态。结果:肝癌、癌旁和远癌组总RNA浓度呈明显的梯度升而趋势(P<0.05);癌组织总GGT、膜结合和可溶性GGT均高于癌周又远癌组织(P<0.05);在癌、癌旁及远癌组织中,特定基因片段的扩增检出率分别为100％、85％、75％,M_3位点低甲基化频率分别为75％、55％、50％。结论:肝癌组织中GGT呈异常表达与基因低甲基化状态有关。

几种肺癌细胞系中FHIT基因和蛋白表达的研究

目的研究不同人肺癌细胞系FHIT基因和蛋向的表达，为探讨外源FHIT基因对不同FHIT状态人肺癌细胞恶性表型的影响筛选受体细胞。方法提取B01D（人肺巨细胞癌细胞系）、LTEP-A2（人肺腺癌细胞系）、LTEP-Sm（人小细胞肺癌细胞系）和A549（人肺腺癌细胞系）细胞总RNA，定量后逆转录合成cDNA第一链，分别用5131、3D1和5U2、3D2两对引物进行巢式PCR扩增FHIT基因外显子1～10。1．5％琼脂糖凝胶电泳检测4种细胞株的FHIT基因表达。将扩增的PCR产物纯化后进行DNA测序。用FHIT单克隆抗体进行免疫组化染色检测4种细胞FHIT蛋白表达。结果801D和LTEP-Sm细胞有正常FHIT基因转录本，LTEP-A2细胞有一条正常FHIT基因转录本和一条异常转录本，正常转录本测序显示与FHIT cDNA同源，无缺失及重排。801D和LTEP-Sm细胞FHIT蛋向表达呈强阳性。A2细胞FHIT蛋白表达减弱。A549缺乏FHIT基因转录本和蛋白表达。结论4种细胞系代表3种FHIT基因状态，为进一步研究外源FHIT基因对不同FHIT状态人肺癌细胞恶性表型的影响提供了合适的受体细胞。

采用改良(1,3)-β-D-葡聚糖检测法监测某部中心医院侵袭性毛孢子菌感染情况

目的分析不同标本、不同检测方法的灵敏性与特异性,评价某部中心医院特殊人群侵袭性毛孢子菌感染情况。方法 (1)筛选某部中心医院毛孢子菌感染高发部门可疑感染者,分段收集不同体液标本。(2)对比传统G试验与改良G试验检测(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)含量的敏感性与假阳性率差异。(3)巢式聚合酶链反应(PCR)法检测标本中毛孢子菌特异性DNA片段。结果改良G试验的敏感性和准确度均较传统G试验提高(P<0.05),假阳性和假阴性率均下降。入院1周时,采用改良G试验获得的血浆、支气管肺泡灌洗液和尿液的阳性率高于入院2周时。入院1周时改良G试验在血浆和支气管肺泡灌洗液中的敏感性高于巢式PCR,而巢式PCR的特异性优于前者,差异有统计学意义(P <0.05)。结论改良G试验与巢式PCR扩增法相结合,可以提高毛孢子菌感染的检出率、降低假阳性率,并缩短检出时间。

梅毒螺旋体的巢式PCR检测与基因分型

目的探讨广州地区梅毒螺旋体基因型分布,确定其分子流行病学特点。方法收集2002-2004年间连续就诊的疑似梅毒患者的生殖器溃疡标本,用暗视野显微镜和巢式PCR检测梅毒螺旋体,阳性者进行巢式PCR扩增酸性重复蛋白基因(arp)和苍白螺旋体重复基因族(tpr),凝胶电泳分析arp基因重复序列个数和tpr基因的MseⅠ酶切片段多态性。根据Pillay标准基因分型。结果共检测62例疑似硬下疳病例,33例(53．2％)暗视野镜检发现梅毒螺旋体；54例PCR检测阳性,阳性率为87.1％。47例arp基因分型以14型为主(36例占76.6％),49例tpr基因分型以d型为主(39例占79.6％),47例双重基因分型发现7个基因型,依次为14 d 31例占66.0％,13 d 5例占10.6％,14 b 4例占8.5％,12 b 3例占6.4％,12 d 2例占4.3％。15 d和14 i各1例占2.2％。结论巢式PCR法检测梅毒螺旋体具有较高的敏感性,广州地区梅毒螺旋体基因型以14 d型为优势型。梅毒的早期诊断和基因分型对于梅毒的防治有重要意义。

微量细胞DNA分型的法医学应用研究进展

微量细胞DNA分型已成为目前法医学研究的热点之一。如果能够从犯罪现场遗留的微量疑难生物检材中提取到细胞,并获得DNA分型,这无疑将会大大拓宽检材的范围。同时可以为刑事案件的侦查提供线索、为法庭量刑提供有力的证据。本文从微量细胞的捕获、DNA模板的制备、扩增和检测及应用前景几个方面综述了微量细胞DNA分型在法医学中的研究进展。

沙眼衣原体检测及分型的方法学比较研究

对COBAS AMPLICOR系统、多重PCR和巢式PCR扩增沙眼衣原体（CT）质粒和，或外膜蛋白（omp1）VD2基因，并以反向线点杂交技术（Reverse line blot hybridization assay, RLB）进行CT血清学分型对CT检测方法进行了比较。

人疱疹病毒8型ORF26基因亚型与鳞状细胞癌的相关性研究

目的探讨新疆鳞状细胞癌（简称鳞癌）患者感染人疱疹病毒8型（HHV-8）ORF26基因亚型。方法巢式PCR扩增41例皮肤鳞癌、46例食管鳞癌石蜡包埋组织标本中HHV-8ORF26基因，对PCR阳性产物进行双向测序，使用Dnastar软件、ClustalW软件和Phylip软件包对测序结果进行系统发生学分析，从而确定HHV-8ORF26基因亚型。运用SPSS17．0进行统计学分析。结果41例皮肤鳞癌组织标本9例HHV-8感染为阳性，阳性率为21．95％；46例食管鳞癌10例为阳性，阳性率为21．74％。新疆皮肤鳞癌患者感染HHV-8ORF26亚型7例为A亚型，2例为c亚型；食管鳞癌感染HHV-8ORF26亚型7例为A亚型，3例为C亚型。结论新疆鳞癌患者感染HHV-8ORF26亚型属于A亚型和C亚型，A亚型多于c亚型，亚型分布与鳞癌患者的发病部位无关。

超声造影引导下粗针活检联合XpertMTB/RIF检测在周围型肺结核诊断中的应用价值

目的:评估超声造影引导下粗针活检联合半巢式全自动实时荧光定量核酸扩增检测技术(XpertMTB/RIF)在周围型肺结核诊断中的应用价值。方法:回顾性分析2016年6月至2018年6月浙江省中西医结合医院结核科疑似周围型肺结核的71例住院患者,所有患者肺部肿块均经超声造影引导下穿刺活检,穿刺组织标本分别进行常规病理检查、XpertMTB/RIF检测及结核分枝杆菌(MTB)培养,以“肺结核诊断和治疗指南”为诊断金标准,比较3种检测方法诊断周围型肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确性。并计算受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC),采用t检验比较3种诊断方法的诊断效能差异。以药敏试验为诊断结核标准,评估XpertMTB/RIF方法检验利福平耐药的准确性。结果:71例患者诊断为周围型肺结核40例(结核组),非周围型肺结核患者31例(非结核组)。非结核组包括肺部恶性肿瘤10例,肺部良性肿瘤1例,间质性肺炎14例,胞内分枝杆菌肺炎3例,真菌性肺炎3例。常规病理、XpertMTB/RIF检测及MTB培养3种检测方法的诊断敏感度分别为80.0%、92.5%、12.5%,特异度分别为90.3%、100%、100%,阳性预测值分别为91.4%、100%、100%,阴性预测值分别为77.8%、91.2%、47.0%,准确性分别为84.5%、95.8%、50.7%。XpertMTB/RIF的诊断敏感度高于常规病理检查及MTB培养,差异具有统计学意义(χ2=33.632、5.976,P均<0.05)。ROC曲线分析显示常规病理、XpertMTB/RIF检测及MTB培养3种检查方法AUC分别为0.814、0.963、0.563,XpertMTB/RIF的诊断效能优于常规病理检查及MTB培养,AUC比较,差异具有统计学意义(t=7.579、2.303,P均<0.05)。结论:超声造影引导下粗针活检联合XpertMTB/RIF检测技术能快速、准确地对周围型肺结核进行诊断,相对于常规病理检查、MTB培养具有较高的诊断效能。