巢式多重聚合酶链反应快速诊断儿童脑膜炎/脑炎

目的探讨巢式多重聚合酶链反应(PCR)在儿童脑膜炎/脑炎诊断中的价值。方法采用回顾性病例对照研究。收集2017年5月—2020年5月上海市儿童医院82例确诊或疑似中枢神经系统感染患儿的脑脊液样本。收集患儿临床资料,了解患儿抗菌药物使用情况。采用巢式多重PCR检测病原体,并同步进行细菌培养、脑脊液常规和生化检测。结果82例脑脊液样本中,有31例检出病原体,其中20例检出病毒、11例检出细菌。细菌组脑脊液样本白细胞计数、蛋白、乳酸脱氢酶和患者抗菌药物使用天数、住院天数均显著高于病毒组(P<0.05);葡萄糖水平低于病毒组(P<0.05);阿昔洛韦使用例数少于病毒组(P<0.05)。巢式多重PCR与培养法判断细菌性脑膜炎/脑炎的一致性较好(Kappa=0.659,P<0.001),与实验室指标判断病毒性脑膜炎/脑炎的一致性亦较好(Kappa=0.737,P<0.001)。结论巢式多重PCR可以作为辅助诊断中枢神经系统感染患儿脑脊液样本病原体感染的新方法,可提高儿童脑膜炎/脑炎的诊断效率。

快速检测细菌并革兰分型的半巢式聚合酶链反应及其初步应用

目的以半巢式聚合酶链反应(PCR)检测细菌及作革兰阴、阳性分型,并与细菌培养法比较。方法以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物(pm1,pm3)和一条革兰阴性型特异性引物(pm2),以半巢式PCR方法扩增实验室保留菌株的DNA并作出革兰染色分型;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBVDNA阳性血清以及白假丝酵母菌为对照,检测此方法的特异性;采用倍比稀释菌液作敏感性实验;与细菌培养法比较,验证此方法检测临床标本的敏感性。结果对17个实验室保留菌株进行检测,以通用引物对作第1次PCR均得到371bp长度的DNA片段;再以革兰阴性菌特异引物对(pm2,pm3)作第2次PCR,9种阴性菌均得到353bp的DNA片段,而8种阳性菌未被扩增。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明,采用半巢式PCR可检测出3个CFU的细菌。对120份临床标本检测,半巢式PCR检测阳性率(29.2%)显著高于细菌培养法检测阳性率(17.5%)。结论此半巢式PCR检测细菌方法,具有特异、敏感、快速的特点,并能对细菌进行革兰阴性、阳性分型,可用于临床感染性疾病的初步诊断。

巢式聚合酶链反应技术在流感嗜血杆菌b型检测中的应用

目的评价巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术在b型流感嗜血杆菌(Hib)检测中的应用价值,估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。方法对2000—2003年北京、上海、广州细菌监测项目中,呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi,用E试验法检测氨苄西林耐药情况后,用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测。结果检出74株氨苄西林耐药Hi。nested-PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致,74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib,约占2.7%。结论nested-PCR b型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充。3地4年内呼吸道感染的儿童鼻咽部携带的氨苄西林耐药Hi中,Hib的比率处于相对较低的水平。

实时定量聚合酶链反应与巢式聚合酶链反应在289例白血病融合基因检测中的比较

目的比较实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)与巢式聚合酶链反应(nPCR)在白血病融合基因BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO检测中的结果。方法分别应用RT-PCR与nPCR对289例急慢性白血病初诊和完全缓解的患者BCR/ABL、PML/RARa及AML1/ETO融合基因进行检测,结合患者骨髓细胞形态学及临床转归予以分析。结果 46例初诊慢性粒细胞白血病(CML)患者中,RT-PCR与nPCR检测BCR/ABL融合基因阳性率分别为95.7%和93.5%(P=0.997);69例完全缓解CML患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为78.4%和58.1%(P<0.05)。32例初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者中,RT-PCR与nPCR检测PML/RARa融合基因阳性率分别为93.8%和90.6%(P=0.996);114例完全缓解APL患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为12.3%和7.0%(P<0.05)。12例初诊急性粒细胞白血病M2(ANLL-M2)患者中,RT-PCR与nPCR检测AML1/ETO融合基因阳性率分别为50.0%和50.0%(P=1.0);16例完全缓解ANLL-M2患者中,RT-PCR与nPCR检测阳性率分别为50.0%和12.5%(P<0.05)。结论 RT-PCR较nPCR更为敏感而准确,应用RT-PCR可以提高微小残留病的检出率,为临床诊断和治疗提供更为有效的分子生物学依据。

利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达

目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系。利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况。结果确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子。利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整。结论巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整。时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用。

巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究

目的用巢式聚合酶链反应(PCR)对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测。方法根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增。对不同型别A组轮状病毒标准毒株和68例A组轮状病毒腹泻的粪便标本进行了G、P型别的检测。结果不同型别A组轮状病毒标准毒株分别扩增出不同长度片段的条带。68例被检测的A组轮状病毒腹泻粪便标本中G分型以G3为主,P分型以P8为主,其余型别少见。结论巢式PCR检测A组轮状病毒基因型的分型具有较高的灵敏度,操作简便快速,适用于临床检测。

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。

桉树焦枯病菌巢式聚合酶链反应快速检测方法的建立与应用

桉树焦枯病是威胁桉树生长的首要病害,建立准确、有效的桉树焦枯病巢式聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)快速检测技术是桉树焦枯病前期诊断的必要手段。本研究针对柱枝双孢霉(Cylindrocladium scoparium)菌株的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因上保守序列极强的靶基因区域序列进行特异性引物BT-S-1/BTA-1的设计和通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A的合成,分别利用常规PCR和巢式PCR技术对引物特异性和灵敏度进行检测和比较,同时本研究也对所建立的巢式PCR用于桉树焦枯病原菌快速检测的田间时效性进行验证。试验结果表明:利用beta-tubulin基因序列通用引物BT-T1-S/BT-CYLTUBIR-A对全部供试菌株进行扩增,所有参试菌株均可扩增出1条约500bp的条带;而单独使用特异性引物BT-S-1/BT-A-1进行常规PCR扩增时仅病原菌能够扩增出1条148bp的明亮条带;当利用通用引物作为第1轮引物,以稀释10倍后的第1轮PCR产物作为第2轮PCR模板,利用特异性引物进行巢式PCR扩增时,也可扩增出上述148bp大小的明亮条带,且巢式PCR的扩增效果较常规PCR具有明显的视觉优越性;灵敏度检测试验表明,巢式PCR的灵敏度可检测到5fg/μL,较常规PCR可以扩增出的极限(DNA质量浓度为5pg/μL)至少提高了103倍;田间时效检测试验也说明巢式PCR较常规PCR具有更高的准确度和灵敏性,可达到田间检测的要求。本研究建立的巢式PCR检测技术可有效应用于桉树焦枯病的早期诊断。

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应快速检出含漱液中的乙型流感病毒

目的建立特异敏感的快速检测含漱液中的流感病毒的分子生物学方法。方法用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增甲１、甲３和乙型流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，得到各病毒与特异性大小的扩增产物的对应关系。用同样的方法扩增含漱液中流感病毒的ＨＡ基因的ＨＡ１片段。根据这对应关系检测含漱液中的流感病毒。结果以流感病毒的ＨＡ基因为模板设计的三对引物，用多重逆转录聚合酶链反应能特异性地扩增出９４２ｂｐ、１１１７ｂｐ和 ７５１ｂｐ的核酸片段，它们分别和甲１、甲３和乙型流感病毒有稳定对应关系。用多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应扩增含漱液中流感病毒ＨＡ基因的ＨＡ１片段，根据扩增产物的大小检出含漱液中的乙型流感病毒。结论 多重逆转录聚合酶链反应和半巢式多重聚合酶链反应能特异敏感地检出含漱液中的乙型流感病毒。

巢式聚合酶链反应快速检测血液标本中伤寒沙门菌的实验研究

目的建立一种检测血液中伤寒沙门菌的方法。方法根据伤寒沙门菌特异鞭毛基因设计两对引物 ,通过巢式聚合酶链反应 (PCR)扩增伤寒沙门菌DNA片断 ,扩增产物通过凝胶电泳进行分析。结果用伤寒沙门菌DNA系列稀释液进行试验 ,巢式PCR能够检出 10个伤寒沙门菌。 36份培养阳性标本 ,33份PCR阳性 ;6份培养阴性但临床高度可疑的伤寒病人标本PCR阳性 ;10份其它原因引起发热的临床标本均为阴性。结论巢式PCR能够快速、特异、准确地检出血液中的伤寒沙门菌。

反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中CK20mRNA

目的建立一种简便、快速的检测血中微量大肠癌细胞CK20mRNA的方法。方法用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中大肠癌标准细胞株VoLo的CK20mRNA。结果浓度分别为1、10、100、1000个/mL的大肠癌标准细胞株LoVo的每份标本,均扩增出了符合所设计片段大小的303bp的目的产物条带。结论用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中微量存在的大肠癌细胞CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,可以大力地推广于临床。

巢式聚合酶链反应检测不同人群隐匿性乙型肝炎病毒感染

目的:探讨不同人群隐匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染情况。方法:采用巢式聚合酶链反应(PCR)检测268例健康献血员、386例健康体检自然人群、73例不明原因肝炎患者、26例丙型肝炎患者、38例肝硬化患者和36例肝癌患者血清HBV DNA。结果:隐匿性乙型肝炎病毒感染率分别为0.37%、4.92%、35.62%、19.23%、10.53%和16.67%。隐匿性HBV感染者中,抗HBc或抗HBc和抗HBe阳性者占51.29%。结论:隐匿性HBV感染在不同人群中广泛存在,其与抗HBc存在高度相关。

半巢式聚合酶链反应在浆膜腔细菌感染诊断中的初步应用

目的观察革兰分型半巢式聚合酶链反应(PCR)在浆膜腔细菌感染诊断中的应用价值。方法对30例浆膜腔积液标本,以细菌16SrRNA基因为靶序列,采用一对通用引物和一条革兰阴性菌特异性引物,以半巢式PCR方法进行检测,并同时作细菌培养。结果以通用引物对30例标本作第1次PCR,11例扩增出371bp长度的DNA片段,阳性率为36.7%;对阳性PCR产物再以革兰阴性菌特异性引物作第2次PCR,9例扩增出353bp的DNA片段即为革兰阴性菌。对此30例标本作细菌培养,阳性率为16.7%,低于PCR扩增法。5例标本细菌分离结果与半巢式PCR革兰分型结果相同。结论革兰分型半巢式PCR方法能够灵敏地检测细菌并作出革兰阴性、阳性分型,对于浆膜腔感染的早期诊断具有较好的应用价值。

半巢式聚合酶链反应一次加样法检测血液HBV DNA

目的 消除巢式聚合酶链反应 (nestedPCR)检测乙型肝炎病毒 (HBV)实验中 2次加样带来交叉污染的机会 ,提高PCR特异性和敏感性。方法 通过设计内部、外部引物的不同长度和不同反应浓度 ,改变退火温度 ,建立半巢式PCR一次加样法检测HBVDNA。 3个PCR引物同时加入反应管进行 2次PCR反应 ,在一个反应管内完成巢式PCR。结果 该法可检出 4个分子的目的基因片段。在 16例ELISA和常规PCR检测HBV阴性的血清标本中 ,半巢式PCR一次加样法检出 2例阳性。结论 该方法简便、敏感、特异。与ELISA同时应用 ,可提高临床标本HBV阳性检出率 ,减少假阴性 。

巢式聚合酶链反应检测人类DNA修复基因:ERCC2/XPD exon 6突变

背景与目的:探讨血样DNA来源困难及DNA产量低的情况下,获得理想的可供突变分析的PCR产物的方法。材料与方法:应用巢式聚合酶链反应(NPCR)-限制性片断长度多态(RFLP)技术检测了人类微量DNA样品的DNA修复基因:ERCC2／XPD exon 6的单核甘酸多态(SNP)。 结果:该位点群体基因分型结果显示:自身平衡检验结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则。 结论:巢式PCR技术在扩增微量DNA、分析突变的实验中较一般单次扩增PCR技术更具有敏感性高,特异性强的优点。

巢式聚合酶链反应在支气管内膜结核诊断的价值

目的 :了解巢式聚合酶链反应 (NPCR)技术对支气管内膜结核 (EBTB)的诊断价值。方法 :应用巢式聚合酶链反应 (NPCR)对 2 2例支气管内膜活检组织进行结核分支杆菌DNA检测 ,并与病理检查、刷检涂片、支气管镜检后痰涂片结果比较。对照为 2 6例支气管肺癌患者。结果 :2 2例EBTB活检组织病理检查、刷检涂片、支气管镜检“激惹”后痰涂片及NPCR检测阳性率分别为 9%、18%、2 7%和 6 4% ,后者与前三者相比差异有显著性 (P均 <0 .0 1)。 2 2例支气管肺癌患者结核分支杆菌DNA的NPCR均阴性。结论 :巢式PCR技术有利于EBTB患者的诊断 ,尤其对胸片 (或CT)正常、痰菌阴性、支气管内膜活检组织未发现结核特异性病理变化者。

巢式聚合酶链反应检测SEN病毒方法的建立

目的 建立用于 SEN病毒 (SENV)检测的巢式聚合酶链反应 (n PCR)方法。 方法 选择 SENV各亚型间高度保守的 5′端非编码区 (5′-NCR)序列设计 2对特异性引物 ,建立可同时检测 SENV所有亚型的 n PCR方法。对 1 73份慢性乙型肝炎 (CHB)患者血清和 96份正常人血清进行 SENV检测 ,并随机选择 3份 PCR阳性产物进行克隆测序。 结果 倍比稀释实验表明该方法的终检稀释度为 1 0 3。PCR产物克隆测序结果显示 :各分离株与 Genbank收录的 SENV序列相应区段同源性为 95 %～ 96%。CHB患者 SENV感染率为 86.1 % ,正常人为 85 .1 % ,二者差异无显著性 (χ2 =0 .3 81 ,P=0 .5 3 7)。 结论 该方法敏感、特异且简便经济 ,适于开展

巢式逆转录聚合酶链反应检测肝癌患者外周血AFP mRNA的临床意义

目的 评估肝细胞癌 ( HCC)患者外周血甲胎蛋白 m RNA( AFP m RNA)检测的临床意义。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应技术 ,对肝癌患者外周血 AFP m RNA进行检测。结果 37例肝癌患者中 AFP m RNA阳性 16例 ( 4 3.2 % ) ,2 5例肝硬变患者中 AFP m RNA阳性 2例 ( 8.0 % ) ,2 0例正常对照无 1例阳性 ;AFP m RNA阳性的 HCC患者肝外转移发生率 ( 87.5 % )显著高于 AFP m RNA阴性的 HCC患者 ( 33.3% ) ,差异有显著性 (χ2 =10 .85 6 ,P≤ 0 .0 0 1,OR=14 .0 0 ,95 %可信区间 CI=2 .4 6 4～ 79.5 5 0 ) ;不同临床分期的 HCC患者其 AFP m RNA检出率不同 , 期患者检出率 ( 6 1.9% )明显高于 、 期检出率 ( 18.8% ) ;AFP m RNA的检出率与血清 AFP水平不同无明显相关。结论 巢式 RT- PCR方法是检测外周血残癌细胞 AFP m RNA的一种灵敏可靠技术 ,检测外周血中的 AFP m