巢式聚合酶链反应技术在流感嗜血杆菌b型检测中的应用

目的评价巢式聚合酶链反应(nested-PCR)技术在b型流感嗜血杆菌(Hib)检测中的应用价值,估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。方法对2000—2003年北京、上海、广州细菌监测项目中,呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi,用E试验法检测氨苄西林耐药情况后,用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测。结果检出74株氨苄西林耐药Hi。nested-PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致,74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib,约占2.7%。结论nested-PCR b型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充。3地4年内呼吸道感染的儿童鼻咽部携带的氨苄西林耐药Hi中,Hib的比率处于相对较低的水平。

脊髓性肌萎缩症单细胞巢式聚合酶链反应技术的建立及初步应用

目的建立单细胞巢式聚合酶链反应技术,并探讨进行脊髓性肌萎缩症基因诊断的可行性,为植入前遗传学诊断奠定基础。方法应用显微操作技术从外周血中分离单个淋巴细胞,制备单细胞DNA模板。分别应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法扩增正常对照者外周血中单个淋巴细胞运动神经元生存(SMN)基因第7、8号外显子,计算其阳性率,建立SMN1基因的单细胞巢式聚合酶链反应技术。并应用该项技术及限制性酶切对1例脊髓性肌萎缩症患者进行基因诊断。结果正常对照者巢式聚合酶链反应共扩增60个外周血单个淋巴细胞SMN1基因第7号外显子,其中54个扩增成功,阳性率为90%;引物延伸预扩增共扩增10个外周血单个淋巴细胞,巢式聚合酶链反应分别扩增SMN1基因第7、8号外显子,在20个聚合酶链反应扩增中共有17个单个淋巴细胞扩增成功,阳性率为85%。应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法对1例脊髓性肌萎缩症患者单个淋巴细胞扩增后经限制性酶切显示SMN1基因缺失,结果与全血基因组聚合酶链反应-限制性酶切一致。结论巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增方法各有优缺点,巢式聚合酶链反应耗时短、操作简便,可作为脊髓性肌萎缩症患者单细胞基因诊断的首选方法。

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

联合常规细胞遗传学技术、多重巢式聚合酶链反应技术检测120例急性白血病患者遗传学异常

探讨如何提高急性白血病患者染色体/特异融合基因异常的检出率与准确率。联合常规细胞遗传学技术、多重巢式聚合酶链反应技术对120例急性白血病患者进行检测。结果表明:应用常规细胞遗传学检测出82例核型异常,占68.3%,而应用多重巢式聚合酶链反应技术检测出54例融合基因异常,占45%。联合这两种技术,120例急性白血病患者的遗传学异常检出率为:75%(90/120),其中有65例明确了具体染色体改变或特异性融合基因异常。30例患者经常规细胞遗传学检测出具有t(8;21)(q22;q22)或t(15;17)(q22;q12),多重巢式聚合酶链反应技术检测出39例患者具有AML1/ETO、PML/RARA或CBFB/MYH11融合基因异常。当存在染色体数目异常,或者不存在19种融合基因之一时多重巢式聚合酶链反应结果为阴性。提示常规细胞遗传学技术联合多重巢式聚合酶链反应技术可以有效地提高急性白血病患者染色体异常/特异性融合基因的检出率。

应用MAGE A1～6普通引物的逆转录巢式聚合酶链反应技术检测肺癌Sanghoon Jheon, et al. Lung cancer

背景由于肺癌患者的死亡率仍在很高水平，开发敏感的检测方法仍是一项迫切的任务。本文作者设计了普通黑素瘤抗原基因(MAGE)引物用以同时检测出MAGE A1-6亚型。这些引物应用于经痰标本检测肺癌。方法这一研究包括了53例癌症患者组和3个非癌症组(193位健康人，

数字聚合酶链反应技术对甲状腺结节术前良恶性的鉴别诊断价值

目的探讨数字聚合酶链反应(dPCR)技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。方法收集2019年6月至2022年9月在该院进行超声引导下细针穿刺细胞学检查(FNAC)且接受手术治疗的甲状腺结节患者穿刺液标本141份,采用dPCR和扩增阻滞突变系统(ARMS)-PCR检测BRAF V600E基因突变,dPCR同时检测NRAS Q61R基因突变、TERT基因启动子C228T和C250T突变。以患者术后病理检测结果为金标准,比较几种方法的准确率,评价dPCR技术在甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断中的价值。结果141份穿刺液标本中,dPCR对BRAF V600E的检出率为69.50%(98/141),ARMS-PCR对BRAF V600E的检出率为64.54%(91/141),差异有统计学意义(P<0.05);dPCR检测NRAS Q61R、TERT C228T、TERT C250T在甲状腺乳头状癌(PTC)中的突变检出率分别为15.32%(17/111)、12.61%(14/111)和1.80%(2/111)。单独使用dPCR检测BRAF V600E鉴别诊断甲状腺结节良恶性的准确率为89.36%,明显高于ARMS-PCR(84.40%)和FNAC(77.30%),差异均有统计学意义(P<0.05)。dPCR(BRAF V600E)+FNAC的诊断准确率为97.16%,dPCR多基因[BRAF V600E+NRAS Q61R+TERT(C228T+C250T)]+FNAC的诊断准确率为97.87%,均高于单独dPCR(BRAF V600E)、dPCR(多基因)的诊断准确率,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论dPCR可检测出ARMS-PCR漏检的基因突变位点,也可以弥补FNAC的不足,该技术联合FNAC可提高甲状腺结节术前良恶性鉴别诊断的效能。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

基因测序技术与聚合酶链反应(PCR)技术在医学检验中的应用分析

比较基因测序技术与聚合酶链反应(PCR)在结核病诊断中的效能,为结核病的规范化诊断提供循证依据。方法 前瞻性随机对照研究。纳入2022年6月-2023年6月住院的100例疑似结核病患者,随机分为PCR组和测序组,每组50例。分别采用PCR和基因测序技术对痰液等临床标本进行检测,判断结核分枝杆菌阳性。比较两组的诊断敏感性、特异性、准确性及检测时间。结果 测序组诊断结核病的敏感性、特异性、准确性分别为96.00%、98.00%、97.00%,均高于PCR组的84.00%、90.00%、87.00%,差异均有统计学意义(P<0.05)。测序组的检测时间为(4.5±1.2)h,短于PCR组的(6.8±1.6)h(P<0.05)。结论 基因测序技术在结核病诊断中的敏感性、特异性、准确性及检测速度方面均优于PCR方法,有望成为结核病诊断的"新贵"。将基因测序技术规范化应用于结核病的常规诊断,有助于结核病的早期发现和精准治疗,对控制结核病流行,降低疾病负担,保障人民健康具有重要意义。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

逆转录多重巢式聚合酶链反应技术在急性单核系白血病M4/M5MLL基因重排检测中的应用

目的探讨逆转录多重巢式聚合酶链反应(多重PCR)技术在初诊M4/M5患者MLL基因重排检测中的价值。方法采用骨髓直接或短期培养法制备染色体,应用R显带技术进行核型分析。采用多重PCR技术,检测40例初诊M4/M5患者中5种急性髓系白血病常见的MLL融合基因以及MLL部分串联重复。结果R显带揭示7有涉及11q23的易位,包括t(6;11)(q27;q23)、t(9;11)(p21;q23)、t(11;17)(q23;q21)、t(11;19)(q23;p13.1),14例有其他核型异常,19例为正常核型。多重PCR证实了7例核型分析显示11q23易位标本中的6例,例3核型分析揭示46,XX,t(6;11)(q27;q23),多重PCR检测MLL/AF6为阴性;19例显带分析为正常核型标本中检出2例MLL部分串联重复。结论多重PCR是对初诊M4/M5患者进行各种MLL重排筛检的有效方法。

聚合酶链反应方法检测阴道毛滴虫准确性的meta分析

目的系统评价聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的应用价值。方法检索中国知网数据库(CNKI)、万方数据知识服务平台、维普数据库和PubMed数据库自建库到2023年5月30日以来基于PCR方法检测阴道毛滴虫的研究文献。经文献筛选、数据提取后,使用软件RevMan 5.4.1和网页服务Meta-Disc 2.0进行Meta分析。结果共纳入36篇文献,16454个临床样本。Meta分析结果显示:聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的合并敏感度为0.972(0.943,0.987),合并特异度为0.979(0.968,0.986),诊断比值比为1643.398(673.168,4012.008),阳性似然比为46.209(30.549,69.897)和阴性似然比为0.028(0.013,0.059);亚组分析表明不同性别的临床样本不会影响聚合酶链反应的检测准确性,但不同的PCR检测方法的准确性有差异。结论聚合酶链反应检测阴道毛滴虫的准确性较高,具有良好的应用价值。

巢式多重聚合酶链反应快速诊断儿童脑膜炎/脑炎

目的探讨巢式多重聚合酶链反应(PCR)在儿童脑膜炎/脑炎诊断中的价值。方法采用回顾性病例对照研究。收集2017年5月—2020年5月上海市儿童医院82例确诊或疑似中枢神经系统感染患儿的脑脊液样本。收集患儿临床资料,了解患儿抗菌药物使用情况。采用巢式多重PCR检测病原体,并同步进行细菌培养、脑脊液常规和生化检测。结果82例脑脊液样本中,有31例检出病原体,其中20例检出病毒、11例检出细菌。细菌组脑脊液样本白细胞计数、蛋白、乳酸脱氢酶和患者抗菌药物使用天数、住院天数均显著高于病毒组(P<0.05);葡萄糖水平低于病毒组(P<0.05);阿昔洛韦使用例数少于病毒组(P<0.05)。巢式多重PCR与培养法判断细菌性脑膜炎/脑炎的一致性较好(Kappa=0.659,P<0.001),与实验室指标判断病毒性脑膜炎/脑炎的一致性亦较好(Kappa=0.737,P<0.001)。结论巢式多重PCR可以作为辅助诊断中枢神经系统感染患儿脑脊液样本病原体感染的新方法,可提高儿童脑膜炎/脑炎的诊断效率。

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

目的建立多重荧光定量聚合酶链反应法(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌的方法。方法根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×10^(2)CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×10^(2)CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×10^(2)CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H73种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。

荧光定量聚合酶链反应检测脑脊液中结核分枝杆菌DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎的应用价值分析

目的 探究荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测脑脊液中结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA对鉴别诊断结核性脑膜炎(tuberculous meningitis,TBM)的应用价值。方法 选择2019年7月—2021年6月于安陆市普爱医院就诊的存在脑膜刺激征的80例患者作为研究对象,所有患者均经MTB培养后明确诊断,将确诊为TBM的37例患者分入脑膜炎组,疑似TBM的18例患者分入疑似组,非TBM的25例患者分入非TBM组,对3组患者行腰椎穿刺,留取5 m L脑脊液及时送检,分别行MTB培养法、抗酸染色涂片法、荧光定量PCR检测。对比3种检测方法在MTB中的阳性检出率,对比脑膜炎组与疑似组患者MTB的DNA检测数值。结果 脑膜炎组应用荧光定量PCR检测MTB的阳性检出率高于疑似组,差异有统计学意义(P<0.05);脑膜炎组与疑似组采用MTB培养法、抗酸染色涂片法的MTB阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。脑膜炎组患者MTB的DNA检测数值为(4.71±0.97),疑似组患者MTB的DNA检测数值为(4.35±0.83),2组患者MTB的DNA检测值比较,差异无统计学意义(t=1.351,P=0.183)。结论 应用荧光定量PCR检测脑脊液中MTB的DNA,有助于判断TBM患者病情严重程度,在鉴别诊断TBM中具有较高的临床应用价值,为临床诊疗提供新思路及方向,值得临床推广应用。

细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中的应用分析

探究细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中的应用价值。方法 选取我院就诊的800例腹泻患者作为检验样本(2021.11~2023.11期间),使用细菌培养方法,聚合酶链反应(PCR)检测方法,探讨不同年龄段患者的细菌性痢疾检出率。结果 聚合酶链反应(PCR)检测检出率:(75.00%),(33.33%),(50.00%),(41.67%),(40.00%),(27.14%),(33.33%),(60.00%),(50.00%),(55.25%)优于细菌培养阳性检出率:(2.78%),(2.22%),(3.33%),(5.00%),(2.00%),(4.29%),(3.33%),(6.67%),(5.00%),(3.25%),(p值小于0.05)。结论 细菌培养与聚合酶链反应(PCR)检测在细菌性痢疾检测中,聚合酶链反应(PCR)检测方法,应用价值更为理想,可准确的评估患者是否存在细菌性痢疾疾病,有助于临床医师结合检测数据,为患者后期治疗提供理论借鉴依据,进一步改善患者的治疗效果,有临床推广及借鉴意义。

基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术检测EV-A71 RNA及其与病毒3D聚合酶的相互作用

RNA荧光原位杂交(RNA-fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)技术利用荧光标记的核苷酸探针,通过互补链杂交,对细胞或组织中特定的RNA序列进行检测和定位。由于RNA-FISH产生的阳性信号较弱,需要结合特异性信号放大,提高信噪比。但传统信号放大技术的背景难以消除,无法定量且分辨率低,是RNA-FISH技术应用的巨大障碍。本文基于第3代杂交链反应(hybridization chain reaction version 3.0,HCR v3.0),利用一对分裂式探针消除非特异杂交背景,并引发荧光信号放大反应,建立了针对肠道病毒A71(enterovirus-A71,EV-A71)RNA的敏感、特异的FISH检测方法,并将该技术与蛋白免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测结合,通过高分辨率激光共聚焦成像,成功地在单个细胞水平上检测了EV-A71感染细胞后病毒RNA与其聚合酶3D蛋白的分布变化和相互作用情况,并对细胞中病毒RNA和3D蛋白进行定量。发现相较于传统定量方法,如逆转录定量聚合酶链反应和免疫印迹,新一代RNA-FISH技术在单个细胞水平上病毒RNA和3D聚合酶的表达情况与群体细胞检测的结果在趋势上有明显差异。这说明,基于杂交链反应的新一代RNA-FISH技术,可以克服群体细胞数量增减掩盖病毒组分变化的缺点,从而真实反映病毒在单个细胞中的变化。

应用巢式聚合酶链反应技术检测乳汁中乙型肝炎病毒

应用巢式聚合酶链反应技术检测乳汁中乙型肝炎病毒王国棠，孟庆珍，贺昕红，张国庆，傅希贤，田庚善乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）母婴传播途径较为复杂，除宫内感染和分娩过程中感染外，产后母婴密切接触也可传播ＨＢＶ，其中母乳喂养途径不可忽视。以往国内外学者对母乳中乙型...

用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中CK20mRNA

目的建立一种简便、快速的检测血中微量大肠癌细胞CK20mRNA的方法。方法用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中大肠癌标准细胞株VoLo的CK20mRNA。结果浓度分别为1、10、100、1000个/mL的大肠癌标准细胞株LoVo的每份标本,均扩增出了符合所设计片段大小的303bp的目的产物条带。结论用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中微量存在的大肠癌细胞CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,可以大力地推广于临床。

双重荧光定量聚合酶链反应技术在食品微生物检验中的应用

随着人民生活水平的不断提升,使得人们逐渐对食品安全产生了更高的重视程度。这一背景下,在食品进入到市场之前,需要采取各种方式对食品进行检验,以及时发现存在安全问题的食物,并禁止进入到市场中,从而向社会群众提供安全性较高的食物。双重荧光定量聚合酶链反应技术是其中较为常见的检测技术,用于对食品微生物含量的检测。基于此,本文通过对双重荧光定量聚合酶链反应技术的介绍,进而分析了其在食品微生物检验中的具体应用,之后以此为基础,阐述了技术应用时的注意事项,以更好地开展食品微生物检测工作提供支持。