应用巢式聚合酶链式反应技术检测孕妇人微小病毒B19非结构蛋白DNA

目的 探讨巢式PCR技术检测人微小病毒B19(B19病毒 )非结构蛋白DNA的灵敏性及特异性。方法 参照经典的巢式PCR技术检测B19病毒结构蛋白DNA的方法 ,检测 30例孕妇血清及胎盘绒毛组织中的B19病毒结构蛋白及非结构蛋白DNA。并与人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒等及人类基因组DNA同批作巢式PCR检测 ,以观察巢式PCR检测B19病毒非结构蛋白DNA的特异性。结果 (1)巢式PCR检测B19病毒非结构蛋白DNA的最小检出量为 0 0 0 5fg ,灵敏性可达 0 0 0 5fg。 (2 )B19病毒质粒模板在 10 3bp处出现靶条带 ,而人巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、腺病毒等及人类基因组DNA均无扩增产物产生。 (3)孕妇血清及胎盘、绒毛组织中的B19病毒结构蛋白检出率均为 2 6 7% (8/30 ) ,而非结构蛋白DNA检出率在血清中为 33 3% (10 /30 ) ,胎盘、绒毛组织中均为 2 6 7% (8/30 )。两者比较 ,差异均无显著性 (P >0 0 5 )。结论 巢式PCR技术检测B19病毒非结构蛋白DNA是一种灵敏、特异、简便、快速诊断B19病毒感染的新方法。

巢式聚合酶链式反应检测脑脊液标本中病原体的方法评价

目的探讨巢式聚合酶链式反应(PCR)检测脑脊液标本中病原体的可行性,为疾病的快速临床诊断提供参考。方法源自细菌16S rRNA基因序列设计的巢式PCR技术方法,包括2对引物,2次PCR扩增,第1对引物首次PCR扩增脑脊液标本提取的核酸DNA,第2对引物再次PCR扩增,其DNA模板为第1轮PCR扩增产物。将第2轮PCR扩增产物进行测序,对序列进行比对分析,从而确定感染的病原体。使用DNA微量分光光度测定布鲁氏菌纯菌核酸DNA,将DNA进行倍比稀释,用于巢式PCR敏感性测试。结果巢式PCR能够检测的最低限约为1个核酸DNA拷贝数。应用巢式PCR检测40份临床患者的脑脊液标本,扩增结果表明有37份标本获得约1 460 bp的预期扩增条带(不同细菌扩增片段有差异),测序比对结果显示,检出脑膜炎奈瑟菌7份、产碱假单胞菌1份、草假单胞菌22份、嗜麦芽窄食单胞菌2份、肺炎链球菌1份、未知细菌性病原体4份、未检出3份。结论巢式PCR能够快速检测与鉴定脑脊液标本中的细菌性病原体。

反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

高灵敏度巢式PCR方法扩增HBV全长基因组

探讨一种用于乙型肝炎病毒（HBV）基因组扩增的灵敏度高、广谱性好的巢式聚合酶链式反应（nested PCR）方法，适用于较低病毒拷贝数标本的HBVDNA扩增．通过设计两套通用巢式引物。实现对各基因型（A，B，C，D，E，G）HBV均具有较高的扩增效率；采用两步法分段扩增HBV基因组，对两段目的产物进行测序拼接获得HBV的全基因序列．应用本方法对4组病毒拷贝量（IU／mL）分别为：〉1．0×10^4，1．0×10^3～1．0×10^，2．0×10^2～1．0×10^3，〈2．0×10^2的100份血清标本进行全长基因组扩增，其中75份获得阳性结果，各组阳性率依次为：100％，66．7％，60％，25％．有效扩增灵敏度为2．0×10^2～1．0×10^3IU／mL；而一步法只在病毒拷贝量〉1．0×10^4 IU／mL的标本组中获得15份阳性结果，总的阳性率仅为15％，说明该方法扩增灵敏度明显高于一步法．因此。本方法为HBV流行病学调查研究HBV基因组序列提供了更高的灵敏度，可在流行病学调查中发挥重要作用．

巢式PCR检测人微小病毒B19非结构蛋白DNA的应用价值

目的 从临床流行病学的角度 ,对新的人微小病毒B19非结构蛋白DNA巢式聚合酶链式反应 (PCR)检测方法的效度及信度进行评价 ,探索其运用于临床筛查B19病毒感染的可行性。方法 以国内目前常用的结构蛋白DNA巢式PCR检测结果 ,并结合孕妇的典型临床表现作为诊断标准 ,将 30例孕妇分为B19病毒感染组及非感染组 ,对非结构蛋白DNA巢式PCR的检测结果进行效度及信度评价。结果 新的检测方法血清标本的灵敏度可达 10 0 % ,组织标本的特异度及阳性预测值高于血清标本 ,联合试验有助于提高检测的灵敏度或特异度。结论 非结构蛋白DNA巢式PCR检测方法是一种特异、敏感、简便、快速诊断B19病毒感染的新方法。在临床筛查中 ,血清标本的检测优于组织标本。

猪圆环病毒3型半巢式PCR方法的建立和应用

为建立快速检测猪圆环病毒3型(PCV-3)的方法,以Gen Bank上登陆的我国PCV-3全基因组为参考毒株,设计3条引物,建立了PCV-3半巢式PCR诊断方法。本方法可以扩增出大小为249 bp的特异性条带,与预期大小一致,而猪圆环病毒1型和2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒等对照样品均未扩增出特异性条带。将PCV-3的阳性DNA稀释后作为模板,发现半巢式PCR的检测极限可以达到5×10^(-3)μg/m L。对临床80份样品进行检测,发现半巢式PCR的阳性检出率可以达到27.5%(22/80),而常规PCR的检出率仅为6.25%(5/80)。检测结果表明,本文建立的半巢式PCR方法较为准确、特异和敏感,适用于PCV-3的快速检测和流行病学调查。

检测AML多药耐药基因mRNA表达的多重半巢式逆转录PCR方法的建立

目的建立多重逆转录和半巢式PCR的方法检测急性髓性白血病(AML)多药耐药(MDR)基因mRNA表达。方法分别设计针对5种MDR基因和1种内参照基因的特异性引物,采用多重逆转录和半巢式PCR检测耐药细胞株HL60/VCR和难治性AML患者骨髓标本中的MDR基因mRNA表达。结果应用此多重逆转录和半巢式PCR反应系统,可以特异的在一个反应管内同时检测到5种耐药基因。结论该方法对于检测AML患者MDR基因mRNA表达具有快速、灵敏、简便等特点,能快速同时分析大量样本,对MDR研究、诊断和治疗有一定应用前景。

巢式RT-PCR检测E-cad mRNA相对含量的实验条件探讨

目的探讨巢式RT-PCR检测肺组织中E-cad mRNA相对含量的最适实验条件.方法通过改变巢式RT-PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨巢式RT-PCR反应体系最适浓度和反应条件.结果巢式RT-PCR反应体系为dNTP200μmol/L,MgCl21.5mmol/L,引物600nmol/L,Taq DNA聚合酶0.1U/μL,模板50ng,10×反应缓冲液2.5μL,总体系25μL.反应条件为95℃预变性10min,95℃1min、66℃1min、72℃1min,第2次PCR为35个循环,最后72℃延伸10min.结论建立了E-cad mRNA的相对定量检测方法.

永川毛霉型豆豉在发酵过程中微生物总量与区系变化规律

采用巢式聚合酶链式反应配合变性梯度凝胶电泳技术对永川豆豉发酵过程中微生物区系生态演化进行解析。结果表明:永川豆豉在制曲过程中霉菌和细菌呈对数增长,进入后发酵阶段菌落总数快速下降,并保持在较低水平。永川豆豉在制曲前期有多种乳酸菌生长,后期乳酸菌受霉菌增长抑制,种类减少。在后发酵阶段奥德赛芽孢杆菌(Bacillus odysseyi)、乳酸杆菌(Lactobacillus oligofermentans)和乳酸杆菌(Lactobacillus lindneri)是优势菌群。同时在制曲初期也发现了费格森埃希菌(Escherichia fergusonii)等杂菌生长。永川豆豉制曲阶段优势霉菌是总状毛霉(Mucor racemosus),同时伴有有性根霉(Rhizopus sexualis)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、大孢联轭霉(Syzygites megalocarpus)、米根霉(Rhizopus oryzae)的生长,后发酵阶段有接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)的参与。

转基因玉米59122品系的特异性检测

使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米59122的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序列,并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物,运用半巢式PCR技术建立了59122的品系特异性二重PCR检测方法,扩增片段100bp,横跨pat终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米59122、MON863、MON810、GA21、NK603,转基因大豆Roundup Ready和转基因油菜GT73等为材料,证明本方法与其他转基因作物具有高特异性。本方法在检测59122时,确定出连接体系中线性DNA的最佳质量浓度为1ng/μL左右,检出限达到0.1%,灵敏度为38个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品,或作为常规PCR定性检测后的验证方法。

水稻细菌性褐条病病原的鉴定

为明确从褐条病稻苗上分离出来的病原细菌并与西瓜果斑病菌相区分,对该病原特性进行了研究。分离获得6株褐条病致病菌,其中4株经主要细菌学特性、菌落形态、致病性、Biolog、脂肪酸分析(FAME)、电镜观察、Nested-PCR鉴定及与3株水稻细菌性褐条病标准菌株和2株西瓜果斑病标准菌株的比较,证实了该病是由单极鞭革兰氏阴性细菌Aci-dovorax avenae ssp.avenae引起的。FAME将水稻细菌性褐条病菌误鉴定为西瓜果斑病菌,而用Biolog和nested-PCR鉴定能得到准确的鉴定结果。

肺炎衣原体感染与小儿哮喘发作

为了解肺炎衣原体 (Cpn)感染与小儿哮喘之间的关系 ,并探讨哮喘患儿Cpn感染的诊断及治疗 ,采用微量免疫荧光(MIF)试验及巢式聚合酶链式反应 (nPCR)2种方法对45例哮喘发作期患儿及20例正常对照组进行Cpn检测。结果 :①哮喘组14例nPCR检测阳性 ,对照组1例阳性 ,两者相比差异有显著性 (P<0.05) ,表明Cpn感染与小儿哮喘发作密切相关。②14例nPCR检测阳性患儿在随后的发作中5例 (35.71 %)仍为阳性 ,表明哮喘患儿中慢性或重复Cpn感染较常见。③就诊或住院后5例Cpn感染哮喘患儿接受了大环内酯类抗生素治疗 ,其中3例病情缓解 ,表明对Cpn感染哮喘患儿进行抗Cpn治疗是必要的。④经全自动荧光测序 ,随机抽取的2例阳性标本和Cpn标准株 (CWL_29)的nPCR产物DNA序列完全一致。

卤虫携带白斑综合征病毒的研究

卤虫是虾、蟹苗种培育的关键动物性饵料,查清其能否携带白斑综合征病毒,对培育健康苗种至关重要。2002年7月至10月,自盐田中取野生卤虫,经暂养后选20尾抱卵雌虫,每尾置1个烧杯中,投喂单胞藻,产卵后取出亲体;20d后,每个烧杯中取5尾子一代个体,利用巢式体外DNA扩增技术对亲体和子一代成体进行WSSV病毒检测。检测结果显示:卤虫中可扩增出特异性的、与引物设计吻合的DNA片段;DNA测序分析表明,扩增片段的DNA序列与白斑综合征病毒序列一致;野生卤虫携带白斑综合征病毒的阳性率为58%,实验条件下野生卤虫后代的阳性率为43%;同一家系中,亲代与子代携带病毒的情况不完全一致,不能确定白斑综合征病毒可否通过繁殖,在卤虫世代间进行垂直传播。研究结果表明:卤虫很可能是白斑综合征病毒的携带者,苗种培育和养殖期间投喂卤虫可能造成虾、蟹感染白斑综合征病毒,卤虫检疫是培育健康苗种的关键措施。

树鼩呼肠孤病毒RT-nPCR检测方法的建立及初步应用

目的建立树鼩呼肠孤病毒(TRV)RT-nPCR检测方法,为树鼩的质量控制提供检测方法。方法从三批野外来源的具有感染临床症状的树鼩粪便中分离得到三株病毒,经电镜观察和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)。根据GenBank中已发表的MRV L1基因的保守区域,设计合成巢式引物,对所分离的三株树鼩呼肠孤病毒(TRV1、TRV2、TRV3)的RNA进行RT-nPCR扩增,优化反应条件,进行特异性、敏感性试验。应用RT-nPCR方法对25只野外来源的相同症状疑似病例样本进行检测。结果针对分离到的三株树鼩呼肠孤病毒的RNA进行RT-nPCR扩增,均得到513 bp的特异性目的片段,培养细胞及甲肝病毒、轮状病毒、单纯疱疹病毒阴性对照均未扩增出条带。敏感性试验结果显示可检测到的最小RNA模板浓度为0.01 pg/μL。25只树鼩粪便样本经RT-nPCR检测,有14只TRV阳性,其中死亡动物组10只,检出率为100%;存活动物组15只,检出率为27%。结论建立的TRV RT-nPCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于TRV的常规检测。

新疆石河子及周边地区棉花根际土壤丛枝菌根真菌多样性

【目的】丛枝菌根是陆地生态系统中普遍存在的植物根系与丛枝菌根真菌的共生体,能有效提高植物的抗逆性。棉花是新疆盐碱地种植的主要经济作物。为研究和利用新疆丛枝菌根资源,对新疆石河子及其周边棉花种植区丛枝菌根真菌的种类和数量进行了普查。【方法】采集新疆维吾尔自治区石河子市(北泉镇)及其周边的塔城地区沙湾县(柳毛湾镇、老沙湾镇、钟家庄镇)和昌吉回族自治州玛纳斯县(十户滩镇)共50份土样,通过单个孢子的形态学鉴定和分子鉴定(巢式聚合酶链式反应)对丛枝菌根真菌多样性进行分析。【结果】从新疆石河子及周边地区棉花根际土壤中分离出4属6种丛枝菌根真菌,以类球囊霉属(Paraglomus)为优势属。石河子市北泉镇的丛枝菌根真菌物种丰富度最高,沙湾县柳毛湾镇和钟家庄镇的种类组成和结构相似。【结论】明确了新疆石河子以及周边地区棉花根际土壤中丛枝菌根真菌的种类。该研究为充分利用和开发特色丛枝菌根资源奠定了基础。

三江地区部分肝病患者血清中乙肝病毒基因型的检测

目的探究黑龙江省三江地区部分肝病患者血清中的乙肝病毒基因型。方法采用基因型特异引物的巢式聚合酶链式反应方法对29例乙肝携带者、9例急性肝炎、36例慢性肝炎、19例肝硬化和3例肝癌患者血清中HBV基因型进行分析。结果HBVB型31例(32.3%)、C型62例(64.6%)、有3例患者同时检出基因型B和C。结论三江地区存在HBVB和C型,而且C型为主要基因型,另外还有少数B、C型混合感染。

儿童唾液幽门螺杆菌感染的检测与分析

目的 调查儿童唾液中幽门螺杆菌 (HP)感染情况。方法 采用巢式聚合酶链式反应对 6 2例儿童的唾液进行HP检测。结果 6 2例儿童中唾液HP阳性率为 4 8.4 % (30 / 6 2 ) ;有消化道症状儿童和无消化道症状儿童唾液HP阳性率分别为 6 1.9% (2 6 / 4 2 )、2 0 .0 % (4 / 2 0 ) ,差异有显著性。结论 应重视儿童唾液的HP感染及其与儿童消化道疾病的关系。

不良妊娠结局孕妇人微小病毒B19感染与垂直传播的研究

目的 探讨武汉地区妊娠妇女人微小病毒B19的感染状况、临床表现及母婴垂直传播途径。方法 以不良妊娠结局孕妇作为病例组 ,以同期妊娠顺利孕妇作为对照。采用非结构蛋白DNA巢式PCR检测方法及传统的结构蛋白巢式PCR方法作为并联实验 ,检测孕妇血清及部分妊娠产物中的人微小病毒B19DNA。结果 不良妊娠结局孕妇血清标本中B19病毒DNA检出率为 2 6 32 % (2 0 / 76 ) ,对照组血清标本检出率为 6 98% (12 / 172例 ) ,二者差异具有显著性。B19病毒感染孕妇常见的临床表现有 :孕期反复出现“流感样症状”、“咽喉炎、少数孕妇的面部及躯体出现丘疹样红斑、关节痛 ,平素健康状况较差及贫血者更易感染。在部分自然流产的绒毛组织、死胎及畸胎的胎盘组织、胎儿组织中检测到B19病毒DNA。结论 武汉地区妊娠妇女存在人微小病毒B19的感染 ,并可通过胎盘传播给胎儿 ,导致不良妊娠结局。

巢氏PCR扩增低拷贝HBV全基因组方法的建立及应用

目的建立一种用于低拷贝乙型肝炎病毒(HBV)不同基因型全基因组扩增的巢式聚合酶链式反应(nested PCR)方法及应用评价。方法通过设计和改良一组对HBV各基因型(A,B,C,D,E,F,G)DNA均具有较高扩增效率的通用巢式简并引物,采用两步法分六段(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa,Ⅱb,Ⅲ,Ⅳ)扩增低拷贝HBV基因组,比较不同反应条件对于PCR扩增产物的影响(退火温度,引物浓度),建立一种适合于低拷贝HBV全基因组扩增的方法;同时采用该方法对57份低浓度HBsAg乙肝感染者(HBsAg<10IU/ml)的全基因组进行扩增、测序、拼接并进行评价。结果该方法的灵敏度可达25IU/ml,重复性好,对57份低浓度HBsAg乙肝感染者进行扩增,其中全基因扩增49例(86.0%),各片段(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa,Ⅱb,Ⅲ,Ⅳ)扩增分别为:53例(93.0%),52例(91.2%),54例(94.7%),54例(94.7%),55例(96.5%)和49例(86.0%),说明该方法适用于慢性低浓度HBsAg乙肝感染者HBV DNA全基因扩增。结论该文为慢性低浓度HBsAg乙肝感染者的全基因系列分析提供了高灵敏度、高特异度的方法,可在低浓度HBsAg感染者流行病学调查中发挥重要作用,同时为巢氏PCR扩增反应体系的优化提供了参考。

5-FU门静脉插管化疗对结直肠癌血液微转移的影响

目的:探讨5-FU门静脉化疗对结直肠癌术后癌细胞血液微转移的影响。方法:研究组27例,结直肠癌根治术后接受门静脉化疗,采用巢式RT-PCR方法检测血液中CK20mRNA;同时取23例单纯接受结直肠癌根治术患者作为对照组。结果:研究组和对照组术后外周静脉血中CK20mRNA的阳性率均较术前显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);两组术后即刻抽取的门静脉血和外周静脉血之间CK20mRNA阳性率的差异均无统计学意义(P>0.05);经门静脉化疗后,术后第8、30天外周静脉血CK20mRNA阳性率较术后(即刻)下降,差异有统计学意义(P<0.05);而单纯接受结直肠癌根治术的患者,术后第8、30天外周静脉血CK20mRNA阳性率与术后(即刻)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:手术操作可能会促进结直肠癌细胞的血液微转移,而术后早期5-FU门静脉连续化疗可以降低血液微转移的风险。