应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化。结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带。巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致。该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA。初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段。

巢式逆转录多聚酶链反应检测大肠癌外周血中CK20m RNA

目的 :研究大肠癌患者外周血中 CK 2 0 m RNA作为大肠癌细胞微转移的标志。方法 :巢式逆转录多聚酶反应 (RT- PCR)法。结果 :CK2 0 m RNA巢式 RT- PCR最低可检测到每 5 ml血液中仅存 5个结肠癌细胞的存在 ;大肠癌组 32例 ,外周血中 CK 2 0 m RNA阳性率 5 6 .2 6 % (18/32 ) ;对照组中 CK 2 0 m RNA均为阴性。结论 :CK 2 0m RNA巢式 RT- PCR可作为大肠癌细胞微转移的敏感而特异的检测方法。

用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中CK20mRNA

目的建立一种简便、快速的检测血中微量大肠癌细胞CK20mRNA的方法。方法用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中大肠癌标准细胞株VoLo的CK20mRNA。结果浓度分别为1、10、100、1000个/mL的大肠癌标准细胞株LoVo的每份标本,均扩增出了符合所设计片段大小的303bp的目的产物条带。结论用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中微量存在的大肠癌细胞CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,可以大力地推广于临床。

巢式逆转录聚合酶链反应检测肝癌患者外周血AFP mRNA的临床意义

目的 评估肝细胞癌 ( HCC)患者外周血甲胎蛋白 m RNA( AFP m RNA)检测的临床意义。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应技术 ,对肝癌患者外周血 AFP m RNA进行检测。结果 37例肝癌患者中 AFP m RNA阳性 16例 ( 4 3.2 % ) ,2 5例肝硬变患者中 AFP m RNA阳性 2例 ( 8.0 % ) ,2 0例正常对照无 1例阳性 ;AFP m RNA阳性的 HCC患者肝外转移发生率 ( 87.5 % )显著高于 AFP m RNA阴性的 HCC患者 ( 33.3% ) ,差异有显著性 (χ2 =10 .85 6 ,P≤ 0 .0 0 1,OR=14 .0 0 ,95 %可信区间 CI=2 .4 6 4～ 79.5 5 0 ) ;不同临床分期的 HCC患者其 AFP m RNA检出率不同 , 期患者检出率 ( 6 1.9% )明显高于 、 期检出率 ( 18.8% ) ;AFP m RNA的检出率与血清 AFP水平不同无明显相关。结论 巢式 RT- PCR方法是检测外周血残癌细胞 AFP m RNA的一种灵敏可靠技术 ,检测外周血中的 AFP m

改良巢式逆转录聚合酶链反应检测大肠癌血中微转移

目的探讨改良巢式RT-PCR法检测大肠癌患者外周血中CK20mRNA的表达情况,并分析其与微转移的关系,建立一种简便、快速的检测血中癌细胞微转移的方法。方法采用改良的巢式RT-PCR技术检测大肠癌患者及正常对照组外周血CK20mRNA的表达。结果CK20mRNA在正常对照组中均无表达,在大肠癌患者中阳性表达率为55.4%(62/112)。不同细胞分化程度大肠癌患者其外周血中CK20mRNA阳性表达率无显著性差异(P>0.05);而不同Dukes分期大肠癌患者其外周血中CK20mRNA阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。结论改良的巢式RT-PCR技术检测血中微转移大肠癌细胞的CK20mRNA具有简便、快速、灵敏的优点,有助于癌细胞微转移的早期诊断,有助于指导辅助化疗和监测疗效。

应用巢式逆转录PCR检测肝癌患者外周血AFP mRNA的临床意义

肝癌细胞极易侵犯肝内血管(主要为门静脉),形成肝内外转移,导致肝癌术后的高复发串和转移率,也是目前影响原发性肝细胞癌(HCC)患者预后最主要的因素。因此,早期发现HCC的微小转移并采取积极措施进行防治将对提高患者的长期生存、改善预后有重要的意义。以巢式逆转录聚合酶链反应(Nested RT-PCR)检测HCC患者外周血AFP mRNA的表达被认为是近年来用于判断和预测肝癌细胞微小转移的敏感和特异的方法。本文就此项研究的临床意义进行综述。

巢式逆转录聚合酶链反应检测冠状病毒的研究

目的 建立一种新的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)反应模式,以提高传染性非典型肺炎(SARS)冠状病毒检测的阳性率和研究病毒在机体的定位状态和致病机理。方法 采用两种RT-PCR反应模式检测SARS患者血浆、淋巴细胞、粪便以及肺组织中病毒核酸。结果 和常规PCR方法相比,新的PCR反应模式能显著提高标本中病毒的检出率,差别有统计学意义;急性期SARS患者淋巴细胞中病毒阳性率较高(84.6％);血浆中病毒阳性率较低(11.5％)。结论 新RT-PCR反应模式可能有利于早期诊断、筛检SARS病原体;淋巴细胞中病毒的检出率较高,提示此类标本可用于SARS实验室诊断,对分析和阐明SARS的发病机制亦可能有一定的指导作用。

激光微切和巢式逆转录聚合酶链反应联合检测单个肝细胞的基因表达

目的 探讨检测单个肝细胞基因表达的方法。方法应用激光微切的方法从冰冻切片上将单个肝细胞切下,提取总RNA,将RNA逆转录成cDNA,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA的表达。结果在显微镜下用紫外激光微切机,将单个肝细胞成功切下,提取RNA后,逆转录成cDNA,巢式RT-PCR的扩增产物在琼脂糖凝胶上清晰可见,其表达与细胞数量成正比。结论联合应用激光微切和巢式RT-PCR可以检测单个肝细胞的基因表达。

巢式逆转录PCR技术检测肝癌组织GPC3 mRNA的表达

目的:探讨肝细胞癌(hepatocellμLar carcinoma,HCC)中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)mRNA的表达及其对肝癌检测的诊断价值。方法:运用巢式逆转录PCR(nRT-PCR)技术检测76例HCC组织及其癌旁组织,对照组33例,同时应用化学发光法对76例HCC患者和33例对照组的血清甲胎蛋白(AFP)进行检测。结果:在76例HCC组织中GPC3高表达的有68例(89.5%),癌旁组织高表达有的31例(40.8%),对照组只有3例(9.1%)表达增高;在44例AFP阳性的HCC患者中GPC3表达阳性的有41例(93.2%),在32例AFP阴性的HCC患者中GPC3表达阳性的也有27例(84.3%),GPC3与AFP联合检测阳性率为93.4%(71/76);结合病理特征提示GPC3的表达不仅与HCC的病理分级有关,还可能与HCC的进展和转移有关。结论:GPC3可作为一种新的肿瘤标志物用于肝细胞癌的早期临床诊断,其与AFP联合检测可有效提高肝癌的诊断率。

逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

巢式逆转录聚合酶链反应在轮状病毒型别鉴定中的适用性

目的以巢式逆转录聚合酶链反应(nested reverse transcription PCR, Nested-RT-PCR)鉴定轮状病毒型别,并对其适用性进行验证。方法提取轮状病毒基因组RNA,以逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR, RT-PCR)扩增轮状病毒VP7基因序列,再以Nested-RT-PCR扩增各型别轮状病毒特异性目的基因片段,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与Genbank报道的相应基因序列片段预计大小进行对比,以确定各毒株的型别。分析该方法的特异性、灵敏度及准确性,对Nested-RT-PCR鉴定轮状病毒型别的适用性进行验证。结果 Nested-RT-PCR法可特异性扩增各型别轮状病毒特异性目的基因片段,所检测的轮状病毒型别特异性目的基因片段与Genbank报道的相应基因序列片段大小相符,可用于轮状病毒型别鉴定。适用性验证结果显示,此方法所用引物特异性好,能特异性扩增相应型别的轮状病毒目的基因片段;具有较高的灵敏度,可检出RNA质量浓度为0.5 ng/μL的样本,其检测灵敏度高于PrimeScriptTM One Step RT-PCR试剂盒检测灵敏度;准确性检测结果与PrimeScriptTM One Step RT-PCR试剂盒检测结果一致,且同型别轮状病毒检测重复试验结果一致。结论该方法特异、灵敏、准确,可有效判断轮状病毒毒株型别,避免了PrimeScriptTM One Step RT-PCR试剂盒检测由于样本含量低而造成的检测结果的假阴性,适用于轮状病毒毒株的检测和多价轮状病毒疫苗的质量控制。

逆转录—巢式PCR法分析胃癌活检组织CD44拼接变异体

目的 改进CD44基因异常表达检测方法，探讨该方法对胃癌早期诊断、转移监测的意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)结合巢式PCR(Nested PCR)技术，检测了89例胃镜活检标本，其中70例胃癌、19例癌前病变(11例非典型性增生、8例肠上皮化生)及其相应的病变旁正常组织活检标本CD44v(CD44拼接变异体)以及CD44v8—10(CD44外显子8—10拼接变异体)的表达。并对巢式PCR产物测序验证其可靠性。结果 建立了逆转录巢式PCR检测胃镜活检标本CD44异常拼接变异体方法。对巢式PCR产物测序证实符合相应的CD44核苷酸序列，结果可靠且更为简便。全部标本均有CD44s(CD44标准型)的表达。胃癌组织CD44v表达阳性率88．6％(62／70)，其中CD44v8—10阳性率72．9％(51／70)。癌前病变组织CD44v表达阳性率为81．8％(非典型性增生9／11)和37．5％(肠上皮化生3／8)，CD44v8—10阳性率在非典型性增生为72．7％(8／11)。病变旁正常组织CD44v阳性率16．9％(15／89)，其中CD44v8-10阳性率13．5％(12／89)。胃癌和非典型性增生组显著高于正常组。本研究对35例在我院行手术治疗的CD44v阳性患者进行了追踪，有2例胃癌患者第1次胃镜检查为非典型性增生，CD44v强阳性表达。分别在第二、三个月后再次行胃镜检查确诊为胃癌。结论 RT—巢式PCR方法灵敏度高、特异性好，应用此法检测CD44v及CD44v8—10在胃癌及非典型性增生活检组织中呈现高表达，可作为胃癌诊断和判断预后的标志之一。

应用巢式RT-PCR检测原发性肝细胞癌患者外周血中的微转移

目的 以AFPmRNA为标志基因 ,检测原发性肝细胞癌患者外周血中微转移情况。方法 应用巢式RT PCR方法 ,检测 71例肝细胞癌、2 1例肝硬化患者、2 8例健康对照、4例转移性肝癌、4例肝脓肿、4例肝血管瘤及 5例其它恶性肿瘤患者外周血中AFPmRNA的表达。结果 71例肝癌患者中 ,AFPmRNA阳性 3 9例 ,阳性率为 5 4.9% ,其中 8例有远处转移的全部阳性 ( 10 0 % ) ,未发现远处转移者阳性 3 1例 ,阳性率为 49.2 %。 2 1例肝硬化患者中仅 2例阳性 ,而转移性肝癌、肝血管瘤、肝脓肿、其它恶性肿瘤、健康对照均为阴性。结论 检测肝细胞癌患者外周血中的AFPmRNA ,是一种早期发现肝细胞癌血道播散的灵敏方法。

巢式RT-PCR检测E-cad mRNA相对含量的实验条件探讨

目的探讨巢式RT-PCR检测肺组织中E-cad mRNA相对含量的最适实验条件.方法通过改变巢式RT-PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨巢式RT-PCR反应体系最适浓度和反应条件.结果巢式RT-PCR反应体系为dNTP200μmol/L,MgCl21.5mmol/L,引物600nmol/L,Taq DNA聚合酶0.1U/μL,模板50ng,10×反应缓冲液2.5μL,总体系25μL.反应条件为95℃预变性10min,95℃1min、66℃1min、72℃1min,第2次PCR为35个循环,最后72℃延伸10min.结论建立了E-cad mRNA的相对定量检测方法.

逆转录多重巢式聚合酶链反应技术在急性单核系白血病M4/M5MLL基因重排检测中的应用

目的探讨逆转录多重巢式聚合酶链反应(多重PCR)技术在初诊M4/M5患者MLL基因重排检测中的价值。方法采用骨髓直接或短期培养法制备染色体,应用R显带技术进行核型分析。采用多重PCR技术,检测40例初诊M4/M5患者中5种急性髓系白血病常见的MLL融合基因以及MLL部分串联重复。结果R显带揭示7有涉及11q23的易位,包括t(6;11)(q27;q23)、t(9;11)(p21;q23)、t(11;17)(q23;q21)、t(11;19)(q23;p13.1),14例有其他核型异常,19例为正常核型。多重PCR证实了7例核型分析显示11q23易位标本中的6例,例3核型分析揭示46,XX,t(6;11)(q27;q23),多重PCR检测MLL/AF6为阴性;19例显带分析为正常核型标本中检出2例MLL部分串联重复。结论多重PCR是对初诊M4/M5患者进行各种MLL重排筛检的有效方法。

逆转录聚合酶链反应在艾滋病患者HIV-1毒株env基因的序列测定和亚型分析中的应用

目的了解深圳地区艾滋病患者中Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)毒株各亚型的感染情况,及其不同亚型对患者疾病进程的影响。方法采用巢式逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法对26例艾滋病患者血浆中的HIV-1毒株的env基因片段进行扩增,并对扩增片段进行序列测定和分析,同时检测其CD4+细胞计数与血浆病毒载量。结果基因系统树显示深圳地区26例艾滋病患者的HIV-1毒株env基因序列,B亚型12例,其中1例与欧美B亚型序列十分接近,11例与中国云南B亚型序列十分接近;循环重组亚型AE(CRF01AE)13例,均与泰国AE亚型序列十分接近。比较B、AE亚型感染患者的CD4细胞计数与病毒载量之间的差异无统计学意义。结论深圳地区艾滋病患者中以HIV-1毒株以B亚型和循环重组亚型AE最常见,尚未观察到B、AE亚型对艾滋病进展的影响。

非小细胞肺癌患者淋巴结、外周血及骨髓微转移分子诊断在肺癌外科治疗中的作用

目的 探讨检测肺癌患者区域淋巴结、外周血和骨髓中微转移在肺癌外科治疗中的临床意义 ,以及区域淋巴结、外周血和骨髓肺癌微转移三者之间的相关性。方法 应用巢式RT PCR技术 ,对 2 9例肺癌患者和 1 1例肺良性病变患者的淋巴结、外周血和骨髓中CK1 9基因mRNA表达进行联合检测。结果 本实验建立的巢式RT PCR技术的敏感性可达到 1 0 - 6。术前 1 0例患者检测到外周血微转移 ,6例患者检测到骨髓肺癌微转移 ,1 0 1枚纵隔淋巴结中 5 5枚检测到肺癌微转移。肺癌患者淋巴结、外周血和骨髓中微转移阳性检出率分别为 5 4 .5 %、3 4 .5 %和 2 0 .7% ,三者之间存在显著正相关 (P <0 .0 5 ) ,外周血和骨髓微转移与肺癌组织学类型、细胞分化程度及P TNM分期均存在密切关系 (P <0 .0 5或P <0 .0 1 )。结论 RT PCR法是一种特异性 ,敏感性均较高的肿瘤微转移检测方法 ;检测CK1 9mRNA表达应用于肺癌微转移的分子诊断有助于选择外科手术适应证 。

乳腺癌患者外周血SBEM mRNA的检测及其临床意义

背景与目的乳腺癌患者的死亡原因几乎均为肿瘤远处转移。目前乳腺癌诊断尚无公认的特异性标志物,本文旨在探讨特异性的乳腺癌标志物─乳腺小粘蛋白(smallbreastepithelialmucin,SBEM)在乳腺癌外周血的表达及其意义。方法用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested-RT-PCR)技术检测67例乳腺癌、16例乳腺良性肿瘤及20例健康志愿者外周静脉血中的SBEMmRNA的表达情况。结果SBEMmRNA在健康志愿者及乳腺良性肿瘤患者外周血中表达均为阴性;67例乳腺癌患者外周血中SBEMmRNA表达率为50.7%(34/67),在乳腺癌患者的临床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期中SBEMmRNA表达率分别为25.0%(2/8)、45.8%(11/24)、43.8%(7/16)和73.7%(14/19),在Ⅳ期乳腺癌患者外周血中SBEMmRNA的检出率明显高于其他各期(P<0.05)。SBEMmRNA的表达与患者年龄、原发癌灶大小、病理类型、ER和PR的状态无关(P>0.05)。结论SBEMmRNA特异表达于乳腺癌患者的外周血,有可能作为判断乳腺癌血道微小转移的指标之一。