刍议活动性肺结核早期检验中半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法的应用研究

目的评估半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法在活动性肺结核早期检验中的应用效能。方法选取2022年9月—2023年9月于平邑县结核病防治所就诊的90例疑似肺结核患者为研究对象,采用Xpert MTB/RIF技术、涂片抗酸染色法检验及简单法固体培养法同时检测90例疑似肺结核患者痰标本,对检测结果进行比较。结果以固体培养结果作为金标准,痰培养阳性率85.56%,阴性率14.44%。Xpert MTB/RIF阳性率84.44%、阴性率15.56%。涂片抗酸染色法检验阳性率48.88%、阴性率51.11%。Xpert MTB/RIF检验的灵敏度97.40%、准确度96.67%、阳性预测值98.68%以及阴性预测值85.71%均高于涂片抗酸染色法检验50.64%、52.22%、88.64%、17.39%,差异有统计学意义(χ^(2)=43.768、46.722、5.922、22.546,P均<0.05)。结论与涂片抗酸染色法相比,在活动性肺结核早期检验中采用半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(Xpert MTB/RIF)的应用效能更高。

荧光定量PCR与逆转录PCR检测HCV RNA的比较分析

目的:用荧光定量PCR(FQ—PCR)和逆转录PCR(RT—PCR)法检测抗-HCV阳性血清中的HCVRNA,探讨两种方法检测结果的临床意义.方法:抗-HCV阳性血清样本1062份,其中481份用RT-PCR法检测,465份用FQ-PCR法检测,另有116份同时用两种PCR法检测.结果:RT—PCR法检测HCVRNA的阳性率为49.90%(240/481),FQ-PCR法的阳性率为62.58%(291/465),两种方法的阳性率有显著性差异(P<0.001).同时用两种方法检测116份,RT—PCR法阳性率为49.14%(57/116),FQ—PCR法阳性率为65.52%(76/116),也有显著性差异(P<0.05).FQ-PCR法检测的40份阴性中RT-PCR法检测出4例HCVRNA阳性.结论:FQ—PCR检测HCVRNA比RT-PCR特异性高,但RT—PCR的敏感性较FQ—PCR高,部分FQ—PCR检测的阴性结果不能排除HCVRNA阳性的可能性.

逆转录实时荧光定量PCR检测p73 mRNA在结肠癌的表达

目的:建立一种实时定量PCR方法检测p73mRNA的表达水平,探讨其与结肠癌发生、发展的可能关系。方法:采用SYBRGreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR检测39例结肠癌组织和其癌旁组织中p73mRNA的表达。结果:p73基因在结肠癌肿瘤组织的表达水平高于其在癌旁组织的表达(P<0.01);表达水平与肿瘤的恶性程度、分化及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论:p73的高表达可能与结肠癌的发生、发展及预后有联系。

荧光实时逆转录PCR定量研究进展

荧光实时逆转录PCR广泛应用于稳态mRNA水平的定量 ,并且它已经成为基础研究、分子医学和生物技术的一种必不可少的实验工具。用此技术定量具有范围宽、敏感性高、精确度高 ,无PCR后处理步骤 ,避免了交叉污染 ,且产出率高 ,可以进行多重检测等特点。然而要成功地应用该技术并不是一件容易的事。现对方法学建立、扩增效率以及标准化等方面作一综述。

实时荧光定量PCR检测端粒酶逆转录酶mRNA在急性白血病中的表达

目的研究人类端粒酶转录酶（hTERT）在急性白血病的表达和意义。方法应用实时定量PCR（Real-time PCR）技术检测30例急性白血病骨髓单个核细胞及25例正常人骨髓单个核细胞中hTERT mRNA的表达水平，分析其表达水平与急性白血病恶性程度的关系。结果hTERT在急性白血病细胞中的中位表达量为0．00244（0～0．0320），明显高于正常人骨髓单个援细胞中hTERT的中位表达量2．79×10^-4（0～0．0078）（P〈0．001）。但在ANLL和ALL细胞中对比表达无明显差异（P=0．742）。结论在急性白血病中hTERT明显高于正常对照，hTERT是急性白血病诊断的特异性指标之一。

非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列,建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针,并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件,确立LNA-OSN-PCR标准曲线,并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法,对96份临床疑似患病样品进行检测,同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系,建立的LNA-OSN-PCR标准曲线,具有较好的线性(R2=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^(-1)copies/μL,变异系数小于3%,并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较,检测灵敏度提高10~100倍,在对96份临床疑似患病核酸样品进行检测中,检出55份阳性,41份阴性,比常规的荧光定量PCR具有更高的阳性检出率。并且能获得典型的扩增曲线。试验结合一步法巢式PCR和锁核酸修饰,建立了ASFV一步法巢式锁核酸荧光定量PCR,为检测ASFV提供一种高灵敏度和高特异性且经济实惠的检测方法。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

应用定量PCR技术检测HIV-1逆转录环节的方法的建立

HIV—1的逆转录作用是其正链RNA在逆转录酶催化下生成双链DNA的过程，是HIV-1复制的重要环节，现已成为抗HIV-1药物研究的重要靶点。本研究应用SYBRGreenI荧光定量PCR技术建立了检测HIV-1逆转录环节的评价方法，

直接从家禽排泄物中检测和定量空肠弯曲杆菌的逆转录定量PCR方法研究

弯曲杆菌属是导致人类细菌性腹泻的主要原因,亟需一种快速而可靠地检测和定量该病原的方法。本研究建立了运用逆转录荧光定量PCR直接从鸡粪便中检测和定量空肠弯曲杆菌的方法,并将其与另一种基于DNA的荧光定量PCR方法和细菌培养方法进行比较。运用细菌培养和逆转录荧光定量PCR方法,可在5d后从人工或天然污染的粪便样品中检测到空肠弯曲杆菌。在使用细菌培养方法无法计数细胞时,逆转录荧光定量PCR亦无法检测到阳性扩增信号,而运用基于DNA的荧光定量PCR方法可以检测到死亡的或无法培养的弯曲杆菌细胞,即使在经过20d保存处理后所有被检测样品仍是阳性。这种直接从鸡粪便样品中检测和定量空肠弯曲杆菌的方法在检测环境弯曲杆菌中的应用还有待进一步研究。

快速检测洋葱伯克霍尔德菌巢式荧光定量PCR法建立

目的建立能直接快速应用于临床检测洋葱伯克霍尔德菌的巢式荧光定量PCR法。方法根据洋葱伯克霍尔德菌recA基因序列设计用于普通PCR扩增的外引物,同时设计用于荧光定量PCR的内引物。分别以洋葱伯克霍尔德菌等细菌的标准株为模板,以外引物进行第一轮PCR扩增;所得PCR产物为模板,以内引物进行染料法荧光定量PCR检测recA基因表达水平,评估巢式荧光定量PCR法的特异性。同时将洋葱伯克霍尔德菌的菌液和基因组DNA进行浓度梯度稀释,继续进行巢式荧光定量PCR,确定此方法的灵敏度。最后用巢式荧光定量PCR法和Vitek 2 Compact仪器分别鉴定35例临床标本,比较两者的检出能力。结果巢式荧光定量PCR法只针对洋葱伯克霍尔德菌有扩增曲线,而对其他菌株无检测信号。同时,巢式荧光定量PCR法的检测下限是1×10^1 CFU/mL的菌液和1×10^⁃5 ng/μL的基因组DNA,具有较高的灵敏度。巢式荧光定量PCR法能有效检测出14例临床标本存在洋葱伯克霍尔德菌感染(检出率为40.0%),而Vitek 2 Compact仪器仅检测出10例(检出率为28.6%),其中4例无法识别。结论巢式荧光定量PCR法具有有效、快速和直接应用于临床检测的优点,并且特异、灵敏和准确等特点,值得在临床推广。

逆转录原位PCR检测博尔纳病病毒感染

目的:建立逆转录原位PCR检测博尔纳病病毒(BDV)的方法,并与其它检测方法进行比较.方法:构建包含BDV GFP-P24质粒的模拟BDV感染的OL细胞模型,检测其核酸的表达.对构建的OL细胞模型和各种阴性对照进行逆转录原位PCR的检测.使用逆转录原位PCR、荧光定量PCR和ELISA对BDV阳性的人和动物样本及阴性对照进行检测,并比较检测结果.结果:成功构建了含BDV-GFP-P24质粒模拟BDV感染的OL细胞.建立了逆转录原位PCR检测BDV的方法;对荧光定量PCR和ELISA的检测呈阳性的4个病例和检测呈阴性的10个病例,使用原位PCR检测可以得到基本一致的结果.结论:逆转录原位PCR原位可以用于检测人和动物的BDV感染和BDV感染机制研究.

实时逆转录聚合酶链反应定量检测人TNF-α mRNA的表达

目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达 TNF-α mRNA 的方法。方法根据 Gene Bank 中 TNF-α mRNA 序列和 MGB 探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人 TNF-α mRNA 的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后进行 TNF-α表达检测。结果本法灵敏度为10~3拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(10~3～10~9拷贝/毫升);特异性好,PCR 产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以 Ct 值计算变异系数(CV 值),批内批间 CV值均小于5%;10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后 TNF-α mRNA 的平均含量分别为10^(4.15±0.49)和10^(5.19±0.43)拷贝/毫升。结论Taqman-MGB 实时荧光 RT-PCR 定量检测人 TNF-α mRNA 表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值。

巢式实时荧光定量PCR检测RA患者外周血单个核细胞TGF-βRⅡmRNA

目的建立检测人外周血单个核细胞(PBMC)中转化生长因子βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)mRNA实时荧光定量PCR方法,并探讨其在RA中的临床意义。方法跨内含子设计外引物,并根据扩增片段,设计一对内引物,采用巢式实时荧光定量PCR(nested-real-time-PCR)方法。首次扩增采用减少引物、酶浓度、及循环次数的方法保持扩增片段的高度特异性,再进行第二次PCR扩增作实时荧光定量检测,同时以β-actin作内参,二者比值作为TGF-βRⅡ表达水平指标。结果Ct值和模板起始浓度对数值之间具有良好的线性关系(r2=0.999);检测最低浓度可达101拷贝。RA患者组和健康对照组的TGF-βRⅡ与β-actin的比值分别为0.45±0.11和0.37±0.10,两者有显著差异(P<0.01);RA治疗前、后两者比值分别为0.46±0.11和0.40±0.11,治疗后下降13.0%。结论巢式实时灾光定量PCR检测PBMC中TGF-βRⅡmRNA的方法简便,特异,重复性好,可信度高,其表达水平对RA具有一定的诊断价值,并可作为评价该病治疗效果的一种方法。

端粒酶逆转录酶启动子热点突变的ARMS-LNA-qPCR检测方法建立

目的建立一种定量检测端粒酶逆转录酶(TERT)启动子区-124bp(C/T)和-146bp(C/T)位点突变率的实时荧光定量PCR方法。方法以常规PCR扩增含有TERT热点突变位点的纯化产物作为检测标本,采用等位基因扩增阻滞原理(ARMS)的引物,并结合锁核酸(LNA)探针作为野生等位基因抑制子,建立实时荧光定量PCR的TERT启动子热点突变率检测方法(ARMS-LNA-qPCR)。在30例表观健康人确定检测下限。结果所建方法的突变率标准曲线为:-124bp(C/T)突变率%=10(0.262×ΔCt+4.325)(P<0.001,R2=0.999),-146bp(C/T)突变率%=10(0.261×△Ct+3.895)(P<0.001,R2=0.999)。在表观健康人中所确定的-124bp和-146bp检测下限分别是0.07%和0.05%。结论所建ARMS-LNA-qPCR的TERT热点突变检测方法具有定量检测突变率并适合临床常规开展的优势。采用普通PCR纯化产物作为检测标本,使得所建方法具有检测各种类型标本的普适性。

利用实时荧光定量RT-PCR检测鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达

依据鸡A-FABP和H-FABP基因及参照基因GAPDH序列设计引物,以鸡心肌、胸肌和腿肌、肝脏和腹脂总RNA逆转录合成的cDNA为模板,GAPDH基因为参照基因,应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测如皋黄鸡和安卡红鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达。结果表明:A-FABP、H-FABP基因和参照基因GAPDH基因融解曲线为单峰,无杂峰及二聚体,其扩增效率分别为99.7%、99.8%和100.0%。如皋黄鸡H-FABP基因在心肌、胸肌和腿肌的差异表达量分别是安卡红鸡的0.0860、0.0680倍和0.0580倍(P<0.05)。H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪含量呈显著负相关。如皋黄鸡A-FABP基因在腹脂和肝脏的表达量分别是安卡红鸡的15.9640倍和10.9640倍(P<0.05),而在心肌、胸肌和腿肌的表达量差异不显著。

牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

目的建立牛结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法根据分枝杆菌的插入序列IS1081设计引物和探针,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验,并用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该方法的敏感性达到了10个拷贝,且特异性高,重复性好。对30份PPD试验和巢式PCR检测都为阳性的临床样本进行荧光定量PCR检测的结果全部为阳性;而对PPD检测阳性,巢式PCR检测为阴性的15份临床样本进行检测时,2份为阳性;在对2份PPD检测阴性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果也为阳性。结论成功建立了牛结核病荧光定量PCR快速检测方法,对临床样品的快速检测和牛结核病的早期诊断具有重要意义。

端粒调控因子及端粒酶逆转录酶相关分析

目的 研究端粒调控因子Tankyrase和端粒酶逆转录酶（hTERT）在胃腺癌组织中的表达水平。并进行相关分析。方法应用荧光实时定量PCR（Real-time PCR）技术检测16例胃腙癌组织和离肿瘤边缘5cm处正常癌旁组织中的Tankyrase和hTERT mRNA表达水平，同时分析Tankyrase表达水平在不同胃腺癌临床分期和组织分化程度各组间的关系。结果胃腺癌中Tankyrase mRNA的表达（1．44×10^2,3.88×10^-5～0．4847）高于正常对照（1．0134×10^-2，0～4．933×10^-2）（T=31，P〈0．05）。hTERT mRNA在胃腺癌中的表达为（1．235×10^-4～0．13301），显著高于正常对照（0，0～4．38×10^-5）（T=0，P〈0．01），两者呈正相关（r=0．553，P〈0．05）。但在不同胃腺癌临床分期、组织分化程度各组之间差异均无统计学意义。结论Tankyrase和hTERT在胃腺癌中表达增高，呈正相关，可能是胃腺癌发生过程中的重要因素。

荧光定量PCR技术检测疟原虫方法初探

目的探索荧光定量PCR技术在献血者疟原虫检测中的应用。方法参照文献设计针对疟原虫18S小亚基核糖体RNA (18S rRNA)基因序列的通用引物和探针并构建标准质粒;将标准质粒和4种疟原虫阳性标本进行梯度倍比稀释后进行荧光定量PCR检测,建立符合本实验室条件的实验体系,与巢式PCR方法进行灵敏度比较,并对47例献血者进行疟原虫筛查。结果应用荧光定量PCR技术检测标准质粒的检测下限是10-1copy/μL,用于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、三日疟原虫(P.malaria)和卵形疟原虫(P.ovale)阳性标本检测,其下限均为1 copy/μL,且整个PCR程序仅用时1 h 59 min;应用荧光定量PCR技术检测47例献血者全血标本,均为阴性;应用巢式PCR技术检测间日疟原虫和三日疟原虫的检测下限为102copy/μL,检测灵敏度明显低于荧光定量PCR检测方法。结论荧光定量PCR检测方法具有操作简单、快速、灵敏、经济等特点,通过针对本实验室的特定实验优化,更加适用于献血者疟原虫的快速大量筛查。

荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估

目的建立灵敏、特异的诺如病毒基因Ⅱ型的荧光定量RT-PCR方法,用于临床腹泻粪便样本病毒的定量检测。方法构建质粒DNA,并转录合成RNA作为标准品,建立和优化诺如病毒基因Ⅱ型荧光定量RT-PCR方法和反应体系,评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测。结果此方法最低可以检出102拷贝数/μl,能特异地检出诺如病毒基因Ⅱ型,与诺如病毒基因Ⅰ型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应。针对标准品,2次批内试验的荧光信号循阈值(Ct值)变异系数(CV)分别为1.60%、0.70%,2次批间试验的变异系数(CV)分别为0.40%、0.40%,均在5%以下。结论本研究建立的实时定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型的方法,其灵敏度、特异性和重复性良好,可用于该病毒的快速检测。

端粒酶逆转录酶在胃癌组织中的表达及临床意义

目的探讨端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在胃癌组织中的表达并分析其临床意义。方法以实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测胃癌组织中hTERT mRNA的表达,同时用MaxVision^(TM)即用型快速免疫组化一步法检测胃癌组织中hTERT蛋白的表达,分析hTERT mRNA及其蛋白表达与胃癌临床病理参数之间的关系,并结合随访资料分析其与胃癌患者预后的关系。结果 hTERT mRNA在胃癌组织中的表达升高(P<0.05);hTERT蛋白在胃癌组织中的阳性表达率(83.3%)明显高于正常胃组织(40.0%)(P<0.05)。hTERT mRNA和蛋白表达水平呈正相关(r=0.733,P<0.05);hTERTmRNA的表达与淋巴结转移、远处转移及临床分期相关(P<0.05)。胃癌患者hTERT mRNA高表达组与低表达组的生存曲线存在明显差异(P=0.015)。结论 hTERT在胃癌组织中的表达升高,且和胃癌进展相关,可作为反映胃癌进展及预后的生物学指标。