逆转录-多重巢式聚合酶链反应技术在骨髓增殖性疾病PDGFRB基因重排检测中的应用

本研究旨在探讨逆转录-多重巢式PCR技术在骨髓增殖性疾病(MPD)PDGFRB基因重排检测中的应用价值。利用逆转录-多重巢式PCR技术对146例MPD患者骨髓或外周血标本进行与PDGFRB基因重排相关的融合基因定性检测。结果显示,146例MPD患者骨髓或外周血标本中有8例出现PDGFRB基因重排,阳性率为5.5%。其中3例为TEL-PDGFRB融合基因,2例为HIP1-PDGFRB融合基因,1例为GIT2-PDGFRB融合基因,1例为TP53BP1-PDGFRB融合基因,1例为WDR48-PDGFRB融合基因。结论:运用逆转录-多重巢式PCR方法进行MPD患者PDGFRB基因重排检测,对于疾病诊断有一定指导意义,且可以为药物靶向治疗提供理论依据。

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的 应用半巢式聚合酶链反应 -微孔板杂交法 (半巢式PCR -MPH)检测泌尿生殖道沙眼衣原体 (Ct)。方法 分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增。将下游引物用生物素标记 ,经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后 ,扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获 ,经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交。然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应 ,经过酶底物显色 ,通过测定吸光度来判断结果。结果 主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感 ,比半巢式PCR产物酶切后电泳法高 1 0倍 ,半巢式PCR -MPH法特异性强。该法重复法好 ,批内CV值 <1 0 % ,批间CV值 <1 5 % ;该法在包被浓度为 4mg L、产物 1∶2 0稀释、与微孔板结合 2 0min后加入 1 0pmol mL探针杂交 3 0min ,用 1∶3 0 0 0稀释的酶显色条件下有最佳结果。结论 该法操作简便、敏感性和特异性均高 ,无放射性和EB染料污染 ,适于临床样本的常规检测。

逆转录多重巢式聚合酶链反应技术在急性单核系白血病M4/M5MLL基因重排检测中的应用

目的探讨逆转录多重巢式聚合酶链反应(多重PCR)技术在初诊M4/M5患者MLL基因重排检测中的价值。方法采用骨髓直接或短期培养法制备染色体,应用R显带技术进行核型分析。采用多重PCR技术,检测40例初诊M4/M5患者中5种急性髓系白血病常见的MLL融合基因以及MLL部分串联重复。结果R显带揭示7有涉及11q23的易位,包括t(6;11)(q27;q23)、t(9;11)(p21;q23)、t(11;17)(q23;q21)、t(11;19)(q23;p13.1),14例有其他核型异常,19例为正常核型。多重PCR证实了7例核型分析显示11q23易位标本中的6例,例3核型分析揭示46,XX,t(6;11)(q27;q23),多重PCR检测MLL/AF6为阴性;19例显带分析为正常核型标本中检出2例MLL部分串联重复。结论多重PCR是对初诊M4/M5患者进行各种MLL重排筛检的有效方法。

RT-PCR检测病媒生物SARS冠状病毒结果初报

目的 调查广东重点地区鼠类和蜚蠊是否携带SARS冠状病毒或者是否SARS冠状病毒的宿主 ,为寻找SARS冠状病毒的来源及控制SARS流行提供依据。方法 巢式RT -PCR技术、荧光定量RT -PCR技术。结果 利用SARS冠状病毒特异性引物对广州、中山、江门及恩平等地的 160份鼠肺样品及 15份蜚蠊的体表擦拭子检测结果表明 ,荧光定量RT -PCR未检测到阳性 ,巢式RT -PCR显示来自广州市的 1份蜚蠊体表擦拭子呈可疑阳性。结论 巢式RT -PCR、荧光定量RT -PCR都适合于病媒生物SARS冠状病毒的初步筛选 ,目前未有明显证据显示鼠类及蜚蠊携带和传播SARS冠状病毒 ,仍需作进一步研究。

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高 。

应用ntPCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异

目的建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异及rtA181V变异的快速检测方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株rt236N PCR产物中含有DraⅠ酶切位点(5'-TTTAAA-3'),而变异株rt236T无此限制性酶切位点;使野生株rt181A PCR产物中含有BlpⅠ酶切位点(5'-GCTNAGC-3'),而变异株rt181V无此限制性酶切位点。选取4份应用ADV治疗1年以上出现HBV DNA反跳的临床耐药慢性乙型肝炎患者血清,经PCR扩增、限制性内切酶酶切及凝胶电泳,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。并选择经该方法鉴定的野生株及变异株各1例进行HBV RT区基因序列分析。结果建立的ntPCR-RFLP方法可以检测到102copies/L的HBV DNA;RFLP分析结果与DNA测序结果一致,4份血清标本中检测到1份rtN236T变异,2份rtA181V变异。结论应用ntPCR-RFLP方法检测HBV阿德福韦耐药变异具有灵敏、特异、简便的优点,适用于HBV耐药变异的监测。

MAGE-3基因mRNA的表达在胸腔积液鉴别诊断中的价值

目的研究MAGE-3基因mRNA在胸腔积液中的表达,探讨MAGE-3基因作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断指标的价值。方法采用巢式逆转录-聚合酶链反应(nRT-PCR)方法,检测35例患者(25例恶性,10例良性)胸腔积液中MAGE-3的表达情况。结果10例良性胸腔积液组中,均未见有MAGE-3特异性条带;25例恶性胸腔积液组中,有14例可见MAGE-3特异性扩增条带,MAGE-3基因表达阳性率为56.00%,其敏感性、特异性、诊断符合率分别为56.00%、100.00%、68.57%。结论检测胸腔积液中MAGE-3基因mRNA的表达,可以作为鉴别良、恶性胸腔积液的一个指标。

WT1基因在恶性造血系统疾病儿童中的表达及其意义

目的探讨WT1基因在儿童恶性造血系统疾病中表达的意义。方法采用巢式RT-PCR观察104例恶性造血系统疾病患儿WT1基因表达的相对水平;其中男69例,女35例;年龄1.5～14.0岁;同期检测72例成人恶性造血系统疾病患者作比较,选择12例健康体检者及10例非恶性造血系统疾病患儿骨髓标本或外周血作阴性对照(男9例,女13例;年龄3～12岁)。结果68例急性白血病(AL)患儿中WT1阳性表达49例(72.1%),3例慢性粒细胞白血病(CML)表达阴性,23例恶性淋巴瘤中7例阳性(30.4%),10例骨髓增生异常综合征(MDS)中阳性3例(30.0%),AL与MDS、CML及恶性淋巴瘤WT1阳性表达率比较差异均有显著性意义(Pa<0.01);而在健康体检者及造血系统非恶性造血系统疾病患儿中均表达阴性。各组与成人患者比较无年龄上差异(Pa>0.05),WT1基因表达在ALL均阴性,与急性粒细胞白血病(ALL)比较无显著性差异,在MDS中难治性贫血组显著低于原始细胞增多性难治性贫血及转化型原始细胞增多性难治性贫血(Pa<0.05)。结论WT1基因在恶性造血系统疾病患者中高表达,可作为检测AL微小残留及预测复发的肿瘤标志物;其与MDS疾病进程关系密切,并可作为对MDS疾病发展的高危评估指标之一。

间期荧光原位杂交技术在慢性粒细胞白血病诊断中的应用价值

目的探讨间期荧光原位杂交技术(I-FISH)在慢性粒细胞白血病(CML)诊断中的应用价值。方法同时采用核型分析、逆转录-巢式聚合酶链反应(PCR)以及I-FISH 3种检测方法,对3例临床表现、细胞形态学和细胞化学提示CML可能的患者进行检测。结果核型分析均未发现Ph染色体和其他异常,PCR也均为阴性结果,而I-FISH测得3名患者骨髓中含融合基因的细胞百分率分别为59.0%、71.8%、33.7%,远高于阳性判断值。结论对于仅发生小片断易位或不产生主要bcr/abl融合基因型的慢性粒细胞白血病患者,I-FISH是一种很有价值的确诊手段。

原发性肝癌患者PBMC AFP mRNA表达与其微转移的相关性研究

目的 探讨 PHC患者 PBMC AFP m RNA表达与微转移的相关性。方法 应用巢式 RT- PCR检测 10 2例PHC、2 2例转移性肝癌及其他恶性肿瘤 ,16例慢性乙型肝炎、2 2例肝硬化和 4 0例献血员中 PBMC AFP m RNA表达水平。结果 AFP m RNA在献血员、转移性肝癌及其他恶性肿瘤、慢性乙型肝炎患者 PBMC中均为阴性 ;在 PHC组 PBMC中 AFP m RNA的检出率 (5 6 .86 % ,5 8/10 2 )明显高于肝硬化组 (9.0 9% ,2 /2 2 ,P<0 .0 5 )。 PBMC AFP m RNA的表达与临床分期、门静脉癌栓、肝内转移、远处转移明显相关 (<0 .0 5 ) ,而与肿瘤直径、数目及血清 AFP浓度无明显相关 (>0 .0 5 )。结论 巢式 RT- PCR检测 PHC患者 PBMC AFP m RNA是一种早期发现 PHC血道播散的可靠而又敏感的实验方法。

FHIT基因mRNA在良、恶性胸腔积液中的表达

目的:检测FHIT基因mRNA在良、恶性胸腔积液中的表达水平。方法:采用巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对40例良、恶性胸腔积液进行FHIT基因mRNA表达的检测。随机抽取3例FHIT基因的RT-PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。结果:22例恶性胸腔积液标本中FHIT基因缺失或异常转录的表达率为68.2%(15/22)。18例良性胸腔积液中FHIT基因均正常表达。FHIT基因mRNA在良、恶性胸腔积液中的表达差异显著(P<0.01)。测序结果表明RT-PCR产物确为FHIT基因。结论:胸腔积液中FHIT基因mRNA的检测有望成为鉴别诊断良、恶性胸腔积液的重要方法。

庚型肝炎

河南省庚型肝炎病毒感染情况和基因变异的研究——邢培清等(河南郑州河南省红十字血液中心450053)；《河南医学研究》，2000，9(4)：300-303[目的：为了探讨河南省庚型肝炎病毒的感染情况和河南株庚型肝炎病毒基因的变异特征。方法：利用逆转录-巢式-聚合酶链反应检测庚型肝炎病毒RNA。将扩增产物克隆入T载体，进行测序和分析。结果：非甲一非戊型肝炎中庚型肝炎病毒RNA阳性率为3．33％(1／30)，在丙型肝炎患者中阳性率为6％(3／50)，献血员中阳性率为0．5％(1／200)，对河南株庚型肝炎病毒RNA阳性扩增、克隆、测序，与GenBank中HGV对应位置序列的同源性为90％-98．8％。结论：河南省存在庚型肝炎病毒的感染者，HGV与HCV有重叠感染的现象。献血员中有HGV携带者。

XMRV在我国部分人群中的初步调查

目的检测XMRV是否存在于我国健康献血者和肿瘤患者体内。方法采用巢式反转录-聚合酶链反应方法,检测243例健康献血者和36例肿瘤患者的血液样本中的XMRV RNA,分析XMRV的感染情况。结果在所检测的279例血液样本中,XMRV RNA均呈阴性,各标本对应的内参引物三磷酸甘油醛脱氢酶基因(hGAPDH)均呈阳性。结论在所检测的样本中,没有发现XMRV的感染,需要进一步扩大样本量,探讨XMRV在中国的感染状况。

乳腺癌患者外周血乳腺珠蛋白mRNA和CD44V6-mRNA表达及临床意义

目的研究人乳腺珠蛋白(hMAM)mRNA和CD44v6-mRNA在乳腺癌患者外周血中的表达及临床意义。方法应用巢式-逆转录-聚合酶链反应(Nested-RT-PCR)技术检测67例乳腺癌、16例乳腺良性肿瘤患者和20例健康志愿者外周血hMAM-mRNA和CD44V6-mRNA表达。结果乳腺癌患者外周血hMAM-mRNA阳性表达率为50.7%;Ⅳ期乳腺癌患者外周血hMAM-mR-NA表达率明显高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期者(P<0.05);hMAM-mRNA在健康人外周血无表达,乳腺良性肿瘤中仅6.25%阳性表达,乳腺癌患者外周血hMAM-mRNA的阳性表达率明显高于乳腺良性肿瘤患者及健康人(P<0.05)。而CD44V6-mRNA在乳腺癌、乳腺良性肿瘤及健康志愿者中检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论hMAM-mRNA特异性表达于乳腺癌患者外周血,乳腺癌患者外周血中检测出hMAM-mRNA提示可能有血循环转移;而CD44V6-mRNA作为血液中乳腺癌细胞的标志缺乏特异性。

河南省信阳地区鼠类感染立克次体的调查

目的了解河南省信阳疫区鼠类中恙虫病东方体、斑点热及斑疹伤寒立克次体感染状况。方法采用巢式一聚合酶链反应（nested—PCR），对信阳市淮滨县捕获的家鼠肝、脾、肾、血液标本进行扩增恙虫病东方体、斑点热群及斑疹伤寒群立克次体热休克蛋白（groEL）基因并测序分析。采用间接免疫荧光方法（IFA）对家鼠血清标本进行斑疹伤寒病原体、恙虫病东方体特异抗体检测。结果共捕获鼠62只，其中内脏标本中检出恙虫病东方体10份（16．13％），斑疹伤寒立克次体5份（8．06％），斑点热群立克次体4份（6．45％）；血液标本中检出恙虫病东方体5份（8．06％），斑疹伤寒群立克次体4份（6．45％），斑点热群立克次体1份（1．61％）。有5份标本同时检出恙虫病和斑疹伤寒，复合感染率为8．06％。在鼠内脏标本中检测到2株蚤传斑点热病原体R．felis。用IFA检测26份鼠血清抗体，3份恙虫病阳性（11．5％）。结论信阳地区啮齿动物宿主鼠类标本中检测出恙虫病东方体、斑点热群和斑疹伤寒群立克次体，存在复合带菌状况，鼠血清恙虫病东方体特异抗体流行率较高。

分子生物学方法在儿童流行性感冒监测中的应用

目的 建立一种能够快速、特异、有效地直接从临床标本中检测流行性感冒 (流感 )病毒并进行病毒型和亚型鉴别的方法 ,同时了解近年来北京地区A3型流感病毒血凝素重链 (HA1)区基因的变异特点。方法 根据编码A、B型流感病毒膜蛋白M基因的核苷酸序列设计两对引物 ,用于同一逆转录 (RT) PCR反应中 (多重RT PCR) ,根据A、B型毒株扩增产物的大小 (分别为 5 0 6bp和2 61bp)鉴别A、B型流感病毒。另根据编码A1 和A3型流感病毒糖蛋白HA基因的核苷酸序列设计两对引物 ,与B型M基因引物用于同一RT PCR反应中 ,可区分A1 、A3或B型流感病毒 (扩增产物分别为 944bp、10 72bp和 2 61bp)。为提高检测临床标本的敏感性 ,针对A1 和A3型病毒HA基因和B型病毒M基因又设计了 3对引物作为外侧引物 ,进行巢式 PCR反应。根据第二次PCR的扩增产物在 1.2 %的琼脂糖凝胶电泳中的大小即可确定型别。经PCR扩增 1996～ 2 0 0 2年间分离的北京地区A3型流感病毒株HA1区基因 ,测序并进行序列分析。结果 用上述多重RT PCR鉴定流感病毒分离株 15 6株 ,与血凝抑制试验阳性符合率为 10 0 %。用多重巢式 PCR检测 92份已经病毒分离确定为流感的儿科临床呼吸道标本 ,与病毒分离和血凝抑制试验阳性符合率分别为 76.9% (A1 型 )、5 7.1%(A3型 )、

新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒自然感染调查

目的调查新疆伊犁地区不同品种犬博尔纳病病毒（BDV）流行现状和分析其可能的种系来源。方法采用改进的巢式反转录PCR（nRT-PCR）方法，检测犬外周血单核细胞（PBMCs）BDV磷蛋白（p24）RNA基因片段。用BDV核蛋白（p40）RNA片段和质粒PMD19标准品验证p24阳性产物，排除可能的假阳性。验证后的阳性产物进行基因测序、同源比对、氨基酸序列和系统发生学分析。结果8个品种150只犬中，仅哈萨克牧羊犬检出BDVp24片段，阳性率为11．0％（10／91）。基因序列与德国马He／80和德国绵羊s6病毒株同源相似度分别为99．2％和95．7％，氨基酸相似度为100％和89．3％，亲缘关系与He／80最近，其次为s6。结论新疆伊犁地区哈萨克牧羊犬可能存在BDV自然感染，其流行株与该地区伊犁马感染的He／80和引进德国美利奴绵羊的S6病毒株有关。

儿童急性淋巴细胞性白血病E2A／PBX1融合基因的检测及临床意义

白血病是儿童期最常见的恶性肿瘤，其中急性淋巴细胞性白血病（ALL）约占70％。t（1；19）（q23；p13）是小儿ALL较常见的染色体易位之一，大约可在3％-5％的B细胞ALL患儿中发生，此易位涉及1号染色体上的前B白血病1（pre—B leukemia 1，PBX1）基因和第19号染色体上的免疫球蛋白增强子结合因子（immunoglobulin enhancer bindingfactor，E2A）基因，在衍生19号染色体上形成E2A／PBX1融合基因。我们利用巢式逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术研究我院ALL患儿中此易位的发生率，并初步探讨患儿的临床特征。

腋淋巴结阴性乳腺癌外周血微转移检测及临床意义

淋巴结是否转移仍然被认为是乳腺癌预后最重要的因素之一,但腋淋巴结阴性乳腺癌(ALNNBC)患者术后有25%左右的复发转移率[1],如能在早期发现微转移,则可以选择性地采取干预措施进行相关治疗.本研究旨在以巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测ALNNBC外周血乳腺组织特异性的乳腺珠蛋白(hMAM)mRNA的表达,来判断是否可能存在乳腺癌微转移.

丙型肝炎病毒在Ⅱ型冷球蛋白血症冷沉淀物中的存在状态及其意义

目的观察丙型肝炎病毒(HCV)在Ⅱ型冷球蛋白血症(EMC)冷沉淀物中的存在状态及冷球蛋白中单克隆的IgMκ与HCV的离体作用,以进一步研究HCV在特发性冷球蛋白血症发病中的作用。方法采用亲和层析分离6例HCV-RNA(+)的原发性EMCⅡ型病人血清中的冷球蛋白及其组成成分——单克隆IgMκ(Cryo-IgM)与多克隆的IgG,同时分离去除冷球蛋白后的血清中的IgM与IgG,以反转录-巢式聚合酶链反应(RT-nestedPCR)检测HCV-RNA,并观察冷球蛋白IgMκ与HCV的离体结合情况。结果6例冷球蛋白中均含有HCV,且从冷球蛋白中分离的IgG中也可检测出HCV,从冷球蛋白中分离的单克隆的IgM中5例HCV-RNA(-),仅1例HCV-RNA(+)。去除冷球蛋白后的血清中的IgM组分均呈HCV-RNA(-),而IgG组分均HCV-RNA(+),HCV的这种分布与基因型与血清病毒含量无关。在离体状态下,冷球蛋白的单克隆IgM不能与HCV结合。结论Ⅱ型EMC病人血清中的HCV主要与IgG结合,然后再与Cryo-IgM连接形成IgM-IgG-HCV冷球蛋白复合体,Cryo-IgM很难与HCV直接结合,更可能是HCV转化B淋巴细胞后的产物。