巢式PCR-RFLP法对湖南省乙型肝炎病毒Bj和Ba基因亚型的初步鉴定

目的:检测湖南省乙型肝炎病毒(HBV)基因亚型(Bj或Ba)的分布情况,了解基因亚型与HBV致病性的关系,希望以此诠释相同基因型HBV导致不同病情的机制. 方法:随机选取经多对型特异性引物巢式PCR法鉴定为B 基因型HBV的血清标本50例,包括慢性HBV携带者和慢性重型乙型肝炎患者各25例,采用巢式PCR-RFLP法鉴定其基因亚型(Bj或Ba). 结果:50例B基因型HBV均为Ba亚型,没有发现Bj亚型结论:湖南省B基因型HBV可能主要为Ba亚型.相同基因型HBV导致不同病情的机制可能还与其他因素(如HBV准种)有关.

应用巢式PCR-RFLP方法鉴别微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的研究

应用巢式聚合酶链反应(NestedPCR)-限制片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymor-phism,RFLP)方法对微小隐孢子虫(C.parvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)和火鸡隐孢子虫(C.melea-grides)的鉴别进行了研究。结果显示C.parvumBOCC2、C.andesoniBOCC2和C.meleagridesCHCC1扩增产物片段大小分别为830bp、828bp和828bp,扩增产物分别经VspⅠ酶切后形成3种不同的RFLP图谱,根据RFLP图谱可鉴别C.parvum、C.andersoni和C.meleagrides。本研究为我国隐孢子虫的分类和隐孢子虫病的分子流行病学研究打下了良好基础。

隐孢子虫SSU rRNA基因的巢式PCR-RFLP分析

目的 建立用巢式聚合酶链反应 (NestedPCR) 限制片段长度多态性 (Restrictionfragmentlength polymor phism ,RFLP)检测、鉴别微小隐孢子虫 (Cryptospordium parvum)和安氏隐孢子虫 (C .andersoni)的方法。 方法 用巢式PCR技术扩增长春市人和牛粪便中C .parvum与C .andersoni的Small SubunitrRNA (SSUrRNA)部分基因 ,并克隆和测序。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切 ,进行RFLP分析 ,并与GenBank上的 17株隐孢子虫相应序列进行对比分析和系统发育分析。 结果 C .parvumHCC1、C .parvumBOCC1和C .andersoniBOCC1扩增产物片段大小分别为 83 0bp、83 0bp和 82 8bp ,经SspⅠ和VspⅠ分别单酶切后形成 2种不同的RFLP图谱 ,根据RFLP图谱可鉴别C .parvum与C .andersoni。序列分析结果显示 ,C .parvumHCC1与国外牛源C .parvumBOH 6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.3 % ;C .parvumBOCC1与国外牛源C .parvumBOH6、C .parvumGCH1、鹿源C .parvumDR1相应序列同源性均为 99.5 % ;C .andersoniBOCC1与国外C .andersoni相应序列同源性为 99.9%。系统发育分析结果显示 ,隐孢子虫虫种形成了 2个群 ,1个群包括C .parvum、C .baileyi、C .meleagridis、C .felis和C .wrairi,另 1个群包括C .

巢式PCR-RFLP法检测奶牛隐孢子虫及虫种鉴定

采进口奶牛粪样200份,收集每份样品中的卵囊液,采用巢式PCR检测隐孢子虫(Cryptosporidium)18S rRNA基因,并用RFLP进行虫种鉴定,将目的片段克隆到pEGM-T easy vector,测序并进行同源性分析以进一步佐证虫种鉴定结果。结果表明,进口奶牛隐孢子虫阳性率为3.5%(7/200),514bp的目的片段不能被EcoT14 Ⅰ酶切。测序分析表明,获得的18S rRNA基因序列与NCBI上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)相应序列同源性高达99.4%~100%,与安氏隐孢子虫(C.andersoni)同源性仅为91.1%。说明进口牛粪样中检测出的隐孢子虫为微小隐孢子虫。

长白山四种赤杨丛枝菌根真菌侵染多样性的巢式PCR-RFLP分析

采集中国吉林长白山不同海拔的4种赤杨根须样本,利用巢式PCR-RFLP方法检测丛枝菌根真菌(AMF)对样品的侵染情况,PCR结果经限制性内切酶分析.结果表明,赤杨根内AMF存在丰富的基因多样性.AMF的侵染有从宿主混乱性向宿主专一性发展的趋势.东北赤杨AMF的宿主专一性水平最强,球囊霉属已成为东北赤杨的优势侵染类群;其余3种赤杨的AMF则出现宿主混乱现象.宿主因素比海拔因素对AMF侵染有更重要的影响.

应用巢式PCR-RFLP方法鉴别我国常见的几种隐孢子虫

应用巢式聚合酶链反应(Nested PCR)—限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法对微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)和猪隐孢子虫(C.suis)的鉴别进行了研究。结果显示:牛源C.parvum、羊源C.parvum、C.suis、C.andersoni和C.baileyi扩增产物片段大小分别为212,213,213,213,210 bp;扩增产物先后经TaqⅠ、BstUⅠ与MseⅠ酶切,根据酶切后形成的不同酶切图谱可以鉴别C.parvum、C.suis、C.andersoni和C.baileyi。该研究为我国隐孢子虫的分类和隐孢子虫病的分子流行病学调查提供了新的方法。

采用巢式PCR-RFLP检测胰液中突变的Kras基因

采用多聚酶链 限制性片段长度多态性检测技术 ,对临床上可疑的胰腺炎和胰腺癌患者 ,经收集胰液进行K ras基因第 12位密码子突变检测 ,以诊断或鉴别诊断胰腺癌。结果在 2 2份胰液标本中 ,11例胰腺炎均无K ras基因突变 ;在 11例胰腺癌病例中有 9例 (81 2 % )含K

18Sr RNA基因巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫分离株

目的18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(restriction fragment length polymor-phism,RFLP)鉴定上海(简称SH-BOV)和徐州(简称XZ-BOV)两株牛源隐孢子虫。方法改良-抗酸染色确定感染隐孢子虫的上海株和徐州株牛粪,提取DNA后经18S rRNA基因巢式PCR扩增,扩增产物测序后用Blast和MEGA软件进行同源性和系统发育分析。同时扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切,且XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后进行RFLP分析。结果通过18S rRNA基因分析,SH-BOV与1株巴西牛隐孢子虫Cryptospridiumbovis同源性为100%,种系发育树上两者在同一分支;XZ-BOV与安氏隐孢子虫C.andersoni同源性为99%,种系发育树上两者在同一分支。扩增产物分别用SspⅠ和VspⅠ单酶切后,可鉴别出SH-BOV为C.bovis,XZ-BOV为C.andersoni或C.muris。XZ-BOV扩增产物用DdeⅠ酶切后可鉴别出XZ-BOV为C.andersoni。结论上海株牛源隐孢子虫(SH-BOV)鉴定为牛隐孢子虫(C.bovis),徐州株牛源隐孢子虫(XZ-BOV)鉴定为安氏隐孢子虫(C.andersoni)。

巢式PCR-RFLP检测rs9263726位点的实验研究

目的:rs9263726位点(G】A)之A等位基因是预测别嘌呤醇致严重不良反应风险的遗传标记,本研究旨在建立一种直接使用口腔上皮细胞进行PCR结合FokI酶切检测该位点基因型的方法。方法:自行设计扩增产物包含FokI内对照识别序列的引物,以样本的口腔上皮细胞粗处理物为模板,通过巢式PCR扩增跨越rs9263726位点的靶片段,进而根据PCR产物的FokI酶切图谱判断样本基因型。结果:所检样本均能扩增出预期大小的PCR产物,3种基因型的酶切图谱特征明显,且经测序验证结果一致。结论:初步建立了一种基于巢式PCR-RFLP检测rs9263726位点的改良方法,具有简便、快速、准确、低成本等特点。

半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌

目的探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法。方法以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130Ⅰ及DdeⅠ酶切目的片段,凝胶电泳。结果7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致。结论半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定。

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立

猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。

油茶巢式交配子代油脂相关性状的遗传分析

【目的】探究油茶种内杂交和种间杂交的亲本选配机制,为油茶高含油率杂交育种选育提供指导。【方法】以油茶巢式交配设计的种内、种间杂交子代为材料,分别测定种仁含油率、木质素、纤维素和半纤维素含量,分析母本的一般配合力(GCA)、杂交组合的特殊配合力(SCA),解析重要性状的遗传效应。【结果】12个家系的种仁含油率为17.83%~53.55%,木质素含量为4.68%~18.12%,纤维素含量为3.66%~13.04%,半纤维素含量0.54%~12.20%。种仁含油率、木质素、纤维素和半纤维素含量的差异在组合间和母本内父本间达到了显著水平。含油率和木质素、半纤维素含量呈显著负相关关系,其相关系数为-0.489和-0.297。长林4号种仁含油率的GCA最高,达到1.57。各组合的SCA分析表明,含油率SCA为-6.38~4.28,其中含油率SCA高且其余3个性状SCA低的种内杂交组合有40×95和4×18。种间杂交组合含油率的SCA普遍较低,仅53×小2较高,为2.77。除木质素外,含油率、纤维素、半纤维素含量主要受显性效应控制,非加性方差大于加性方差,说明以这3个性状为目标的杂交育种中评估亲本的SCA比GCA更重要。4个性状的单株遗传力范围为10.84%~58.35%,家系遗传力为4.23%~.21.35%,均受到较强的环境效应影响。【结论】以配合力为参考指标,结合各组合的表型数据,选出可用于油茶高含油杂交种质创制的优良种内杂交组合40×95和4×18,种间杂交组合53×小2。

犬弓形虫巢式PCR检测方法的建立及初步应用

弓形虫病是一种重要的人兽共患病,犬是弓形虫重要的中间宿主,有必要建立一种快速、灵敏的犬弓形虫病检测方法。根据GenBank中弓形虫529 bp基因重复序列设计巢式PCR引物,通过优化反应条件建立巢式PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬新孢子虫的基因扩增无条带;灵敏度试验结果显示,该方法最低可以检出0.134 pg的弓形虫基因,比目前国标PCR方法高100倍。对感染弓形虫犬的组织样品检测发现,巢式PCR能在感染犬的不同组织中检测出弓形虫基因。建立的犬弓形虫巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为该病的检测奠定了基础。

常用IUD脱落或下移不良事件风险因素巢式病例对照研究

目的:探讨常用宫内节育器(IUD)发生脱落或下移不良事件的风险因素。方法:采用巢式病例对照研究方法,以2015-2020年参加IUD首诊排查登记且放置数量位为前10位的IUD类型的使用对象为基础建立队列,回顾或前瞻性的收集相应检查结果,其中发生IUD脱落或下移不良事件的对象994例,按照1∶3的方法匹配对照,采用条件logistic回归模型筛选出发生脱落或下移不良事件的可疑风险因素。结果:IUD类型、剖宫产史、副作用以及哺乳均为影响因素。脱落或下移的风险GCu200(OR=2.01,95%CI 1.36~2.96)、GCu220(OR=1.60,95%CI 1.08~2.37)、OCu200(OR=2.00,95%CI 1.25~3.22)、TCu220C(OR=1.56,95%CI 1.10~2.23)、固定式(OR=2.00,95%CI 1.36~2.95)、活性165(OR=2.43,95%CI 1.62~3.64)、活性γ(OR=1.77,95%CI 1.21~2.59)和元宫200(OR=1.45,95%CI 1.02~2.06)高于活性γ(记忆合金);GCu220(OR=1.67,95%CI 1.07~2.60)和固定式(OR=1.66,95%CI 1.06~2.61)高于HCu280;GCu220(OR=0.66,95%CI 0.45~0.97)、HCu280(OR=0.50,95%CI 0.31~0.79)、TCu220C(OR=0.64,95%CI 0.45~0.92)和元宫200(OR=0.60,95%CI 0.42~0.85)低于活性165;有剖宫产史(OR=1.29,95%CI 1.09~1.52)、置器后发生副作用(OR=3.55,95%CI 2.80~4.49)及哺乳使用者(OR=4.62,95%CI 1.09~19.63)发生脱落或下移的风险增高。结论:应针对风险因素选择适合的IUD种类、型号并重视后期随访,以提高育龄妇女生殖健康水平。

水产养殖巢式设计遗传力计算及其在SPSS上的实现

巢式设计是水产育种中重要的遗传设计之一,其遗传力计算涉及平方和类型的选择、固定模型或随机模型的选择及模型修改等,如果处理因素纳入顺序不对,则通过SPSS图形对话框操作不能完成巢式设计方差分析。文章以教材数据为例,介绍巢式设计方差分析的基本原理,利用SPSS软件中对话框粘贴程序进行编程,并通过一般线性模型过程进行方差组分估计及遗传力计算操作演示,并对模型选择、平方和类型选择及巢式设计方差分析SPSS编程的必要性等进行讨论说明,可为教学和科研提供实践参考。

城镇成年居民静态行为与心血管事件关系的巢式对照研究

目的 采用巢式对照研究法分析城镇成年居民静态行为与心血管事件的关系。方法 按照巢式对照研究法,选取2018年4月—2021年4月本市常住城镇成年居民3053人作为研究队列予以随访跟踪,随访截止时间为2022年4月,将队列内发生心血管事件的患者82例作为不良事件组,以1:5的比例匹配未发生心血管事件者410例进行对照,作为无事件组。收集两组一般资料,检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血红蛋白(Hb)、血钙、血磷及空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbAlc)水平与收缩压(SBP)、舒张压(DBP),分析静态行为时间与相关指标的关系。利用多因素Logistic回归分析方法,分析城镇成年居民静态行为与心血管事件之间的关系。结果 不良事件组BMI及TC、TG、LDL-C、FPG、HbAlc、SBP、DBP水平高于无事件组,HDL-C水平低于无事件组(P<0.05)。不良事件组静态行为时间≤2 h/d、(2~4)h/d的占比分别为10.98%、15.85%,低于无事件组的36.83%、32.20%,且不良事件组静态行为时间(4~6)h/d、>6 h/d的占比分别为25.61%、47.56%,高于无事件组的12.93%、18.05%(P<0.05)。患者静态行为时间与BMI、TC、TG、LDL-C、FPG、HbAlc、SBP、DBP呈正相关(r=0.535、0.402、0.431、0.406、0.638、0.796、0.671、0.609,P <0.05),与HDL-C呈负相关(r=-0.418,P <0.05)。通过分析显示,与静态行为时间≤2h/d者相比,(2~4)h/d、(4~6)h/d、>6 h/d者的心血管事件发生风险增高(OR=1.985、2.688、4.680,P均<0.05)。结论 城镇成年居民静态行为时间越长,发生心血管事件风险越高,以静态行为超过2h/d时,心血管事件发生风险有所增高,超过6h/d时明显增高,且其与BMI、血脂、血糖、血压水平存在相关性。

乌鳢水泡病毒(SHVV)巢式PCR检测方法的建立与应用

巢式PCR是建立在普通PCR方法基础之上的一种改进型方案,广泛用于病毒基因的检测。但是,目前还没有建立巢式PCR检测乌鳢水泡病毒的报道。本研究通过获取感染乌鳢水泡病毒的杂交鳢组织,获得病毒的相关基因,利用巢式PCR相关技术,通过体系的建立和反应程序的优化,建立一种检测乌鳢水泡病毒的方法,为及时发现并快速诊断乌鳢水泡病毒提供一项重要的技术手段。

刍议活动性肺结核早期检验中半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法的应用研究

目的评估半巢式全自动实时荧光定量PCR检测与涂片抗酸染色法在活动性肺结核早期检验中的应用效能。方法选取2022年9月—2023年9月于平邑县结核病防治所就诊的90例疑似肺结核患者为研究对象,采用Xpert MTB/RIF技术、涂片抗酸染色法检验及简单法固体培养法同时检测90例疑似肺结核患者痰标本,对检测结果进行比较。结果以固体培养结果作为金标准,痰培养阳性率85.56%,阴性率14.44%。Xpert MTB/RIF阳性率84.44%、阴性率15.56%。涂片抗酸染色法检验阳性率48.88%、阴性率51.11%。Xpert MTB/RIF检验的灵敏度97.40%、准确度96.67%、阳性预测值98.68%以及阴性预测值85.71%均高于涂片抗酸染色法检验50.64%、52.22%、88.64%、17.39%,差异有统计学意义(χ^(2)=43.768、46.722、5.922、22.546,P均<0.05)。结论与涂片抗酸染色法相比,在活动性肺结核早期检验中采用半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(Xpert MTB/RIF)的应用效能更高。