应用巢氏PCR方法快速检测猪鼻拭子样品中产毒素多杀性巴氏杆菌

根据产毒素多杀性巴氏杆菌的toxA基因序列,设计了2对特异性引物,扩增的片段大小分别为864和447 bp,从而建立了一种能直接从猪鼻拭子中快速检测产毒素多杀性巴氏杆菌的巢氏PCR方法。该方法能检出26CFU菌量以上的模板DNA,且不能从猪的其它7种常见病原菌扩增到特异性条带。通过对5个不同地区阳性猪群中采集的146份临床鼻拭子样品进行巢氏PCR检测和细菌分离鉴定,结果2种方法同时为阳性的样品有44份,同时为阴性的样品有97份,另有5份样品只有巢氏PCR检测为阳性,巢氏PCR检测与细菌分离鉴定的符合率为96.58%。试验表明:巢氏PCR方法能快速、灵敏地从猪鼻拭子样品中检出产毒素多杀性巴氏杆菌,适合临床进行大规模病原学检测,具有良好的应用前景。

应用巢氏PCR对成人社区获得性肺炎患者咽拭子中肺炎支原体DNA的检测及耐药分析

目的了解肺炎支原体(MP)在成人社区获得性肺炎(CAP)患者中的感染情况与成人MP耐大环内脂类抗生素的分子机制。方法收集北京友谊医院成人CAP住院患者咽拭子标本,巢氏PCR扩增红霉素作用靶位23S rRNA基因,电泳检测阳性标本行双脱氧末端终止法全自动DNA测序,测序结果与NCBI已登录的MP标准株23S rRNA基因作比对,分析差异基因。结果共收集成人CAP住院病例97例,其中咽拭子阳性25例,阳性率25.8%。15例为耐药株,耐药率为60.0%,均出现2 063位A-G的点突变。结论北京地区成人MP存在耐药现象,主要对大环内酯类抗菌药物耐药,耐药分子机制与国内外文献报道基本相似。

巢氏PCR检测血片中低密度间日疟原虫的研究

目的探讨巢式PCR应用于检测低密度疟原虫血片DNA的方法。方法以健康人抗凝血为稀释液提取不同浓度梯度间日疟原虫血片DNA,测定其最低检出限,将一份含有高密度间日疟原虫的抗凝血样按照1:10、1:100、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000比例进行稀释,制成9个浓度梯度血样。每个浓度血样按照厚血膜5ul、薄血膜2ul同时制作2张血片,连续稀释(9个稀释度)一份含有高密度间日疟原虫的EDTA抗凝血样本,制作标准血片,同时进行所制得的血片中厚、薄血膜通过显微镜计数后,分别用以提取DNA,进行和巢式PCR检测。结果间日疟原虫血片厚血膜的检出限为1:16000(0.8个虫/μl血),薄血膜检出限为1:100,与镜下计数水平一致。结论巢式PCR适用于低密度血片中间日疟原虫DNA的检测,具有较高的检测意义。

奶牛安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法的建立及应用

为了建立敏感、稳定、重复性好的奶牛安氏隐孢子虫的巢氏PCR检测方法,本试验根据GenBank中安氏隐孢子虫18S rRNA和囊壁蛋白(COWP)基因序列设计2对引物,并通过程序优化建立了安氏隐孢子虫巢氏PCR检测方法。结果显示,18S rRNA和COWP巢氏PCR分别扩增出407 bp和430 bp的安氏隐孢子虫特异性基因片段,与预期相符,且扩增出的基因片段与已知基因序列(KX926454)同源性为100%;将阳性样本倍比稀释后进行18S rRNA和COWP巢氏PCR,最低检测量分别为24.3 pg/μL和243 pg/μL,扩增结果与目的片段大小一致,重复性良好,与大肠埃希菌、牛艾美尔球虫、弓形虫均无交叉反应;从华中地区采集的563份样品中,18S rRNA巢氏PCR检测出安氏隐孢子虫阳性185份,而COWP巢氏PCR仅检测出其中的148份;基于18S rRNA巢氏PCR,安氏隐孢子虫阳性率在秋季最高(36.71%),在冬季最低(16.25%),具有显著的统计学差异(P<0.01)。因此,本试验所建立的18S rRNA巢氏PCR和COWP巢氏PCR可为奶牛场安氏隐孢子虫的检测和防控提供有力的技术支持。

大鲵蛙病毒巢氏PCR检测方法的建立

参照GenBank已收录的大鲵蛙病毒MCP基因序列设计特异性引物,建立基于大鲵蛙病毒特异性引物的巢式PCR检测体系。本试验利用大鲵蛙病毒CGSV主要核衣壳蛋白MCP基因保守区,设计内引物和外引物并制备了重组质粒pMD19-T作为阳性对照标准品。灵敏度试验结果显示,巢氏PCR的敏感性较普通PCR的敏感性高1 000倍;而且与草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)、鲫鱼疱疹病毒2型(Goldfish herpes virus,CyHV-2)、云斑尖塘鳢虹彩病毒(Marbled sleepy goby iridovirus,MSGIV)、迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)等无交叉反应。该体系具有简便、快捷、特异性高、低成本等特点,为大鲵蛙病毒检测提供了一项重要的技术手段。

捕获和连接探针PCR与巢氏PCR检测疟原虫效果的比较

目的了解捕获与连接探针PCR(CLIP-PCR)对疟原虫的确认诊断效果。方法云南省疟疾诊断参比实验室提供的血涂片镜检阴性和阳性者滤纸血样各70份,分别进行盲法CLIP-PCR和巢氏PCR检测,以巢氏PCR为金标准评价CLIP-PCR的检测效果及检测耗时,血样梯度稀释后测定CLIP-PCR最低检出阈值。结果检测140份血样,2种PCR检出假阳性和假阴性各1例,CLIP-PCR检测疟原虫的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断准确度均为98.57%,kappa值为0.97;CLIP-PCR耗时13.91 h,较巢氏PCR耗时23.47 h缩短40.73%;梯度稀释后重复检测8次,≥3.2个虫/μl血检出率100%,0.32个虫/μl血检出率50%。结论CLIP-PCR检测疟原虫效果与巢氏PCR相同,重复性良好,更适用于大规模人群筛查。

巢氏PCR法扩增16S rRNA基因检测肺炎支原体

目的目前临床上检测肺炎支原体的微量颗粒凝集法,存在敏感性不高、受时间限制的缺点,本文采用nested PCR方法,扩增16S rRNA基因,试图建立一种敏感性高、特异性强的肺炎支原体检测方法。方法收集256例疑似肺炎支原体感染患儿的咽拭子,采用nested PCR法扩增16S rRNA基因,对比微量颗粒凝集法及传统PCR法检测结果,进行统计学分析。结果 nested PCR法与微量颗粒凝集法对比有早期诊断的特点,nested PCR法与传统PCR法对比,具有较高的准确度、敏感性和阴性预测值。结论 nested PCR法更适合临床应用。

两种巢氏PCR方法检测二期梅毒血液标本的比较

目的比较两种巢氏PCR方法在检测二期梅毒患者血液标本中的价值。方法针对tpp47和pol A,分别建立两个巢氏PCR扩增全血中的梅毒螺旋体DNA。结果在353例梅毒阳性全血中,n PCR-tpp47和n PCR-pol A分别检出142例(40.2%)和132例(37.4%),结果差异有统计学意义(χ2=5.79,P<0.05);两种巢氏PCR在血清学试验高滴度(RPR≥1:8或TPPA≥1:2 560)组的检出率明显高于低滴度组(RPR<1:8或TPPA<1:2 560)。结论在检测二期梅毒全血标本Tp DNA时,n PCR-tpp47优于n PCR-pol A;巢氏PCR方法可作为梅毒血清学试验的补充试验。

运用半巢氏PCR检测方法对区域犬焦虫感染状况调查

犬焦虫病是一种近些年来在世界范围内呈区域性流行的新兴的传染病,其诊断及流行病学调查具有重要意义。为了调查我国深圳地区犬吉氏巴贝斯虫病与韦氏巴贝斯虫病感染状况,同时为小动物临床引入敏感性和特异性较强的犬焦虫半巢氏PCR检测方法。试验于2011年6月至8月在深圳地区采集97份有明显蜱接触史犬的外周血,对样本进行犬焦虫病原学检测。试验采用半巢氏PCR方法针对18S rRNA高变区序列设计引物检测犬吉氏巴贝斯虫与韦氏巴贝斯虫病原。吉氏巴贝斯虫阳性率为34.02%(33/97);韦氏巴贝斯虫阳性率为8.25%(8/97)。这表明深圳地区存在犬吉氏巴贝斯虫与韦氏巴贝斯虫的感染。

圈养东北虎源猫杯状病毒的巢氏PCR检测及ORF2基因遗传进化分析

为了解猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)在圈养东北虎中的流行情况,试验在黑龙江省海林市横道河子东北虎林园与哈尔滨市东北虎林园共采集东北虎血液样本40份,采用巢氏PCR对FCV进行检测,并对阳性PCR产物进行测序和遗传进化分析。结果表明:40份样品中共有4份检测为FCV阳性,阳性率为10%。4株测序毒株分别命名为HB-1516、HD-068、HD-079、HD101,与FCV参考株的核苷酸相似性为76.6%~88.3%;4株测序毒株处在同一分支,且与猫源FCV亲缘关系最近,但与常用疫苗株(F4、F9、F65、FCV2024株)处在不同分支。说明可能存在FCV由猫传染虎的情况,提示目前使用的疫苗不能起到完全保护作用。

贝氏贝诺孢子虫巢式PCR检测方法的建立

根据Gen Bank上发表的贝氏贝诺孢子虫核糖体内转录间隔区(ITS)序列,在传统PCR方法的基础上设计一对特异性内引物,提取病牛血液中贝氏贝诺孢子虫基因组DNA,建立了贝氏贝诺孢子虫巢氏PCR检测方法并进行临床样品检测。结果表明,建立的巢式PCR检测方法能检测到贝氏贝诺孢子虫DNA的最低浓度为24.3 ag·μL-1,刚地弓形虫、犬新孢子虫、牛巴贝斯虫、环形泰勒虫、边缘无浆体DNA检测均为阴性。196份临床血液样本,检测出3份阳性,阳性率为1.53%。由此可见,研究所建立的巢氏PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛贝诺孢子虫病的早期临床诊断。

巢式PCR-RFLP法检测Cystatin C基因多态性的实验研究

目的建立检测高GC含量的CST3基因多态性的巢式PCR-RFLP方法.方法以巢氏PCR方法扩增CST3基因5′端和外显子1的特异性片段,用RFLP方法分析该基因的多态性.结果应用Enhancer System,以巢氏PCR方法能高效扩增出高GC含量的CST3基因5′端和外显子1区的特异性片段,用SacⅡ限制性酶切对CST3基因多态性进行有效分析.结论该方法能准确、高效的对CST3基因多态性进行分析,研究结果对高GC含量基因的研究有借鉴价值.

林木植原体病害传播及PCR检测研究进展

林木植原体病害危害日趋严重,对林业经济和生态造成了巨大损失,但国内林业工作者及相关研究者对其关注较少。为了对林木植原体病害致病机理的深入研究和其快速检测提供理论依据,在对相关文献研究进行总结分析的基础上,综述了主要林木植原体病害传播特性和PCR及高通量测序技术检测的研究进展,同时展望了林木植原体病害PCR检测的研究前景。

反转录巢式PCR检测FⅧ基因内含子22倒位

目的建立凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22倒位的反转录巢氏PCR检测技术,与长链PCR进行比较。方法选取45例已在我院确诊为重型血友病A男性患者及3例血友病患者母亲,应用改良的反转录巢氏PCR检测和长链PCR方法检测患者是否存在内含子22倒位,对22倒位阴性患者进一步做内含子1倒位和二代基因测序验证。结果长链PCR检测45例患者中,内含子22倒位阳性20例,阴性25例。反转录巢氏PCR结果与长链-PCR一致。两种方法检测均阴性患者经二代测序及内含子1倒位检测,证实均存在FⅧ基因非22倒位的突变,其中4例巢式PCR产物凝胶电泳未见扩增条带判读为阴性的样本,2例为大片段缺失,2例为无义突变。结论反转录巢式PCR与长链-PCR对内含子22倒位的检测结果完全一致,有望作为一种快速准确的内含子22倒位检测方法在血友病基因诊断中予以应用。

广西西南部分地区龟隐孢子虫感染情况调查与分析

目的了解广西西南部分地区4种龟类隐孢子虫的感染情况。方法采集4个种类总计148只龟的粪便样品,利用巢氏PCR对18S rRNA基因进行检测和分析。结果龟隐孢子虫总感染率为23.65%(35/148),其中黄额闭壳龟感染率为35.29%(6/17),地龟感染率为29.00%(29/100),黄缘闭壳龟(0/16)和木纹龟(0/15)中未检测出隐孢子虫感染,两种龟类隐孢子虫检测结果均为阴性,感染率为0。不同龟种中,地龟感染了Cryptosporidium.ducismarci,黄额闭壳龟存在Cryptosporidium.ducismarci与Cryptosporidium.testudinis两种隐孢子虫的混合感染。结论广西西南部分地区龟类存在两种隐孢子虫的感染,且C.testudinis隐孢子虫可能对人兽健康存在潜在风险,本研究为明确目前广西西南地区的龟隐孢子虫的流行情况提供了参考依据。

浙江省5例输入性疟疾误诊病例的病原学诊断分析

目的对浙江省5例输入性疟疾误诊病例进行病原学诊断和鉴定。方法收集浙江省5例前期误诊为输入性间日疟患者的流行病学资料和血样,进行镜检、快速疟疾诊断试纸条检测和巢氏PCR检测(采用疟原虫属特异性引物和种特异性引物),并将PCR扩增片段测序后,与GenBank中已有的序列进行Blast比对分析。结果 5例患者均为自非洲的归国人员,其中3例归国前有疟疾发病史。镜检结果显示,4份血样为卵形疟原虫感染,1份(病例1)为卵形疟原虫和间日疟原虫混合感染。快速疟疾诊断试纸条检测结果均为疟原虫阴性。巢氏PCR检测结果显示,5份血样的全血DNA均扩增出卵形疟原虫特异性条带(800 bp),其中1份血样(病例1)同时还扩增出间日疟原虫特异性条带(120 bp)。测序序列经Blast比对,5份血样的扩增片段序列与卵形疟原虫SSU RNA部分序列的同源性均为99%,其中1份血样(病例1)的另一扩增片段序列与间日疟原虫SV5 18S rRNA部分序列的同源性为99%。结论 5例输入性疟疾病例,4例为卵形疟原虫感染,1例为卵形疟原虫和间日疟原虫混合感染。

河南省3例输入性三日疟的诊治分析

采用吉氏染色镜检、CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒和巢式PCR等3种方法,对2011年河南省3例自安哥拉和赤道几内亚归国的三日疟患者血样进行检测。2例自安哥拉归来的患者分别于回国后15 d和27 d发病;另1例患者曾在赤道几内亚发病,归国2个月后再次发病。3例患者均有发热、头痛和畏寒等症状,但发热规律不典型。2例患者出现总胆红素升高、脾大等临床表现。3例患者镜检均可见典型的三日疟原虫形态,巢式PCR检测均扩增出与三日疟预期一致的特异性条带,但CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒检测结果均为阴性,3例患者均经复方青蒿素类药物(ACT)治愈。

灰飞虱体内一种酵母类共生菌的分子鉴定

为明确稻飞虱体内酵母类共生菌(yeast-like symbiont,YLS)的种类,采用超速离心的方法分离纯化灰飞虱Laodelphax striatellus(Falln)体内YLS,用真菌的通用引物对其18SrDNA、5.8S-ITSrDNA全长序列进行扩增。结果得到一条分子量约为2340bp的序列。序列同源性分析表明,该菌与Noda等所报道的类酵母菌的18SrDNA序列差异较大(同源性只有89.6%),而与季也蒙毕赤酵母Pichia guilliermondii有99.8%的同源性。原位杂交(ISH)和巢氏PCR均证明该菌存在于灰飞虱脂肪体和卵内,但数量较少。因此,灰飞虱体内YLS除了Noda等报道的类酵母菌外,尚存在另外一种季也蒙毕赤酵母菌。

三例输入性卵形疟的实验室诊断

目的分析3例输入性疟疾的实验室诊断,减少卵形疟的误诊与漏诊。方法采用形态学检查、巢氏聚合酶链反应(PCR)及序列分析等方法确诊3例输入性疟疾病例。结果 3例患者形态学检查结果分别是未检出疟原虫(实验室初次检查)、检出卵形与恶性疟原虫和检出卵形疟原虫;巢氏PCR检测结果依次是卵形疟原虫感染、卵形与恶性疟原虫混合感染和卵形与间日疟原虫混合感染。结论需加强疟疾消除地区疟原虫形态学检查技术的培训和推广。应用分子生物学检查技术可减少输入性卵形疟的误诊与漏诊。