视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的:从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子(ROP)并建立ROP-绿色荧光蛋白(GFP)融合基因转基因小鼠模型。方法:用PCR法从基因组内扩增ROP,通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体,并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pmROP-EGFP表达质粒经Nol I酶切线性化后,用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核,制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建者小鼠,基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传代后,取眼球进行冰冻切片,在荧光显微镜下观察视网膜上GFP的表达。结果:从基因组内扩增出了2.1 kb的小鼠ROP,成功构建了小鼠ROP-GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建者,分别命名为C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU21、C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26、C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论:成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠,它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制,还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。

当归多糖延缓D-半乳糖所致巢蛋白-绿色荧光蛋白小鼠脑衰老作用及其机制

目的探讨当归多糖（ASP）延缓D-半乳糖（D-Gal）所致巢蛋白（Nestin）-绿色荧光蛋白（GFP）小鼠脑衰老作用及可能机制。方法 6~8周龄雄性Nestin-GFP转基因小鼠40只,随机分为正常组（n=10）、ASP正常组（n=10）、脑衰老模型组（n=10）、ASP脑衰老模型组（n=10）。脑衰老模型组：小鼠皮下注射D-gal 200 mg/kg qd×42 d;ASP脑衰老模型组：从脑衰老模型建立的16d起腹腔注射ASP 140 mg/kg qd×27 d;ASP正常组：皮下注射等量生理盐水,第16天起腹腔注射ASP（剂量与时间同上）;正常组：小鼠皮下注射等量生理盐水42d。模型建立完成第2天水迷宫实验检测各组小鼠的空间记忆能力;取海马制备冷冻切片,观察海马区神经干细胞荧光强度;衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察海马组织中染色阳性细胞百分率;酶标比色法检测海马区超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量;酶联免疫吸附测定（ELISA）检测海马区白细胞介素（IL）-1β,IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α炎症因子变化。结果脑衰老模型组小鼠空间记忆能力减退,海马齿状回（DG区）荧光强度降低,SA-β-Gal染色阳性颗粒增加,海马组织SOD活性和T-AOC降低,MDA含量升高,IL-1β,IL-6和TNF-α含量增多。与脑衰老模型组比较ASP脑衰老模型组小鼠空间记忆能力有明显改善,海马DG区荧光强度增强,SA-β-Gal染色阳性颗粒减少,海马组织SOD活性和T-AOC升高,MDA含量降低,IL-1β,IL-6和TNF-α含量减少。结论 ASP能延缓D-Gal所致小鼠脑衰老,其机制可能与抑制氧化应激损伤、下调炎症因子水平、维持海马区神经干细胞数量有关。

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的研究曲细精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(pCMV-EGFP)表达载体,应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质粒DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右,雄鼠与雌鼠合笼交配;分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southernblotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠,荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果共注射41只雄性小鼠,存活34只,其中32只具有交配、受精能力,获得仔鼠382只。仔鼠经检测,PCR阳性133只,Southernblotting阳性15只。小鼠的年龄、注射剂量与EGFP的整合率没有明显关系,荧光显微镜观察下没有观察到组织冰冻切片中EGFP明显表达。结论曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法慢病毒包装采用三质粒系统。3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G。病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒。将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度。用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下。在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达。将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠。通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平。结果病毒液浓缩前的滴度≥106TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109TU/ml以上。将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1189/1453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132h观察胚胎,均发现有较强荧光。在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率>90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎。胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1453)。将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29)。结论通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠。我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系。

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究

目的研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向诱导下的多向分化潜能。方法取6周龄GFP转基因小鼠1只,用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获得GFP转基因小鼠骨髓MSCs有限细胞系(GFP_MSCs)。取第3代GFP_MSCs进行体外多向分化诱导:成骨诱导后进行碱性磷酸酶增殖活性检测及茜素红钙盐染色;成脂肪诱导20d后进行油红O染色鉴定;成神经诱导6h后用免疫组织化学方法检测神经元烯醇化酶(NSE)的表达。结果GFP_MSCs经成骨诱导后ALP表达较对照组明显升高,20d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导后油红O染色阳性;经成神经诱导后,细胞形态由梭形转变为星状细胞,NSE染色呈强阳性表达。结论GFP转基因小鼠骨髓MSCs在体外诱导下具有多向分化能力,对GFP稳定表达无影响,可以作为研究MSCs多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。

绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

目的测定绿色荧光蛋白转基因小鼠不同年龄段的生理生化、组织病理学等方面的指标,为该品种转基因小鼠应用于毒理学等领域研究提供理论依据。方法定期测定不同周龄段(4～6周龄,6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄)141只绿色荧光蛋白转基因(GFP)小鼠和100只对照组C57BL/6J小鼠的体重和摄食量,对上述两种动物定期取血,测定血生化及血液学指标,对动物进行大体解剖,计算主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺,性腺)的脏器系数并进行组织病理学检测。结果①体重和摄食量:4周龄的GFP小鼠,其体重明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);4～5周龄的GFP小鼠,其摄食量明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。②血常规测定:6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其红细胞计数(RBC)明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其白细胞计数(WBC)明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。③血生化测定:6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其尿酸(UA)值明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其总蛋白(TP),白蛋白(ALB)明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。④脏器系数:6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其胸腺的脏器系数明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其肝脏的脏器系数明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01)。⑤病理检测:6～8周龄有部分GFP小鼠胸腺发育不良,其他受检脏器和其他年龄段动物未见明显病理改变。结论①绿色荧光蛋白转基因小鼠与对照组C57BL/6J小鼠相比,在体重(4周龄)、摄食量(4～5周龄)、血常规(红细胞计数RBC、白细胞计数WBC、血红蛋白HGB)、血生化(尿酸UA、总蛋白TP、白蛋白ALB)、脏器系数(胸腺,肝脏)等指标上存在明显差异,但是其值均在正常范围内。②绿色荧光蛋白转基因小鼠在6～8周龄有部分小鼠胸腺发育不良。

绿色荧光蛋白转基因小鼠脂肪间充质干细胞的多向分化潜能

目的:研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠脂肪间充质干细胞(ADSC)体外定向诱导下的多向分化潜能.方法:取出生后4 d的GFP转基因小鼠腹股沟的皮下脂肪组织,经过胶原酶消化,加入脂肪组织来源干细胞条件培养基中培养.将生长状态良好的第5代GFP-ADSCs分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向分化诱导研究.并分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定.结果:成功获得了稳定表达GFP的ADSCs,GFP-ADSC经成骨诱导20 d后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积;经成脂诱导10 d后油红O染色阳性.结论:GFP作为报告基因在ADSCs分化过程中没有被关闭,亦未影响到ASCs的多向分化潜能,是ADSC在体多向分化研究的一个有效示踪工具.

绿色荧光蛋白转基因小鼠不同源性间充质干细胞原代培养及生物学特性比较

目的：探讨绿色荧光蛋白转基因小鼠脐带和骨髓源性间充质干细胞（ MSCs ）的体外分离培养方法、生物学特性、表面标志及多向分化潜能。方法：应用Ⅱ型胶原酶消化培养法分离脐带MSCs及密度梯度离心法分离骨髓MSCs进行体外培养。在倒置显微镜下观察2种细胞的生长特点，运用生长曲线和MTT法检测其原代细胞增殖能力，台盼蓝法测定细胞传代成活率，采用流式细胞术测定2种第3代（ P3）细胞DNA周期及表面标志物的表达，并比较其向成脂细胞和成骨细胞的分化潜能。结果：酶消化法分离培养的脐带MSCs 1 d后，细胞贴壁呈成纤维形，2 d后呈漩涡状生长且增殖明显，3 d后达80％融合即可传代；应用密度梯度离心法分离骨髓MSCs，体外培养4 d后，细胞贴壁呈圆形、梭形和多角形生长，5 d后呈克隆样生长且增殖明显，7 d后达80％融合即可传代。原代培养的脐带MSCs生长曲线近似“S”形，骨髓MSCs 生长曲线较平缓；MTT法显示脐带MSCs在3～5 d增殖较明显，骨髓MSCs 7 d后细胞增殖较明显。2种P3细胞传代成活率均为96％以上，G0／G1期细胞均为85％以上，无明显差异（P＞0．05）；2种P3细胞CD44、CD90和CD105阳性率均为（60．7±2．3）％以上高表达，CD45、CD19、CD14和CD79a均为（25．6±4．8）％低表达，两者无明显差异（ P＞0．05）；2种MSCs在体外均具有向成骨细胞和成脂细胞分化的潜能，脐带MSCs向成骨及成脂细胞分化率均为90％以上，与骨髓MSCs的分化潜能比较有显著差异（ P＜0.05）。结论：脐带MSCs较骨髓MSCs具有较强的增殖能力及分化潜能。绿色荧光蛋白转基因小鼠的脐带MSCs可作为较好干细胞示踪的细胞源。

绿色荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞移植对海仁藻酸致SD大鼠小脑变性损害的实验研究

目的通过观察绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠神经干细胞(NSCs)移植对海仁藻酸(KA)致SD大鼠小脑变性损害区的存活、迁移情况,为临床上NSCs移植治疗小脑变性提供理论依据。方法SD大鼠40只随机分为正常对照组(A组),KA损伤未移植组(B组),KA损伤后注射生理盐水组(C组),KA损伤后NSCs移植组(D组)。分离、培养GFP转基因小鼠的NSCs,以立体定向微量注射方法移植至KA致小脑变性损害区,进行行为学、免疫组化研究。结果(1)行为学观察:A组大鼠头部及口鼻呈机敏的探索状,四肢及躯干动作协调,尾巴稍抬高,可左右摆动。B组和C组表现为精神差,厌食,少动,行动摇晃迟缓,身体左右摇晃,头部触地,尾巴拖地,多次侧翻跌倒并自己不能翻正,嘴部寻找食物笨拙,过竿时间较A组明显延长。D组行为学表现及过竿时间较A组差,但优于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)免疫组化发现NSCs在小脑变性区存活和迁移,未见细胞过度增生。植入细胞存活数随时间延长而减少,7 d、14 d、28 d分别为(102±67)、(58±77)、(24±6)个/HP,差异有统计学意义(P<0.01)。结论NSCs在小脑变性损害区能够存活、迁移,能够改善KA致小脑变性共济失调症状,提示NSCs移植可成为治疗小脑变性损害的治疗手段。

绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定

背景:转基因动物提取的间充质干细胞自身携带绿色荧光蛋白,与传统病毒、质粒转染相比,能在活细胞中稳定地表达,可较快筛选其修饰的细胞。目的:观察绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法:取2周龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠双侧长骨骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。流式细胞术分析第5代绿色荧光蛋白阳性骨髓间充质干细胞的细胞表型,并分别加入成骨及成脂条件培养液进行体外多向诱导分化,采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。结果与结论:成功获得了稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表达CD90和CD105,不表达或弱表达CD14和CD45。经成骨诱导3周后茜素红染色可见有橘红色钙盐沉积,经成脂诱导3周后油红O染色见红色的脂滴。结果表明稳定表达的绿色荧光蛋白未影响到骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,可作为良好的示踪因子。

绿色荧光蛋白转基因大鼠脂肪间充质干细胞的培养及分化潜能鉴定

目的建立大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外分离培养的方法,并鉴定其分化潜能。方法取SPF级绿色荧光蛋白(GFP)转基因大鼠腹股沟脂肪,用胶原酶法消化获取原代细胞并进行传代培养。获得的P3代ADSCs,观察其细胞形态及荧光强度衰减情况;用流式细胞仪分析其表面特异性标志物,进行细胞表型鉴定;分别用成脂诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化,组织化学染色检测细胞分化的情况;将细胞悬液多点注射于大鼠烧伤创面及创周皮下,观察其定植情况。结果从成体GFP大鼠脂肪组织中成功分离培养出ADSCs,该细胞呈长梭形、漩涡样生长,传代后细胞生长增殖速度加快。ADSCs对CD29、CD90及CD105呈现高表达;对CD34及CD45呈低表达;茜素红和油红O染色显示ADSCs具有成骨成脂多向分化能力;在创面可见散点状绿色荧光。结论成功获得高纯度、稳定表达的GFP转基因大鼠的ADSCs,且生长增殖能力强,具有多向分化潜能。采用GFP转基因大鼠来源的ADSCs简单易行且示踪效果良好,可用于后续实验研究。

绿色荧光蛋白转基因小鼠来源肌卫星细胞的体外培养及体内示踪

目的：从绿色荧光蛋白转基因小鼠中分离培养肌卫星细胞（MSCs）并进行体内示踪。方法：利用差速贴壁结合克隆分选方法，分离了MSCs，并于体外进行培养传代、鉴定及分化。检测所获MSCs的生长曲线及细胞周期并与来源于野生型鼠的同代MSCs进行比较。将绿色荧光蛋白标记的MSCs注射到裸鼠胫前肌，于注射后当时、注射后1周、2周、3周和4周利用二维荧光成像平台进行体内示踪。结果：MSCs被成功分离、传代及鉴定。来源于绿色荧光蛋白（GFP）标记或未标记小鼠MSCs的生长曲线、细胞周期及肌原性分化等无差别。MSCs注射后4周内可以动态观察到注射部位的绿色荧光信号并获得组织学证实。结论：来源于GFP转基因小鼠的MSCs在生长和增殖特性上与未转基因来源的MSCs相似，在体内可以通过二维荧光成像平台进行可靠的、无创性的示踪。

绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB/NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性。取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠。

bcr启动子驱动增强绿色荧光蛋白表达转基因小鼠的制备和初步鉴定

目的制备bcr启动子驱动．增强绿色荧光蛋白（bcr—EGFP）转基因小鼠模型，在活体水平验证bcr启动子的启动特异性。方法以慢性髓性细胞白血病（cML）细胞株K562细胞基因组为模板，PCR扩增1．1kbbcr启动子，在扩增产物的上、下游引物加入了AseI、EcoRI酶切位点．AseI、EcoRI双酶切pEGFP—N1真核表达质粒载体，去除载体自身的CMv启动子，并将1．1kbbcr启动子定向克隆到EGFP绿色荧光蛋白报告基因上游，构建pbcr-EGFP真核表达载体，并将此重组质粒瞬时转染K562细胞和NIH3T3细胞，进行表达验证。显微注射法制备bcr-EGFP转基因小鼠，采用PCR方法进行初步整合检测。结果显微注射583枚受精卵，移植到30只受体鼠输卵管中，受体鼠妊娠26只，共生产首建鼠90只，经过PCR检测，甜（♀）、36挣（♂）和81#（♂）等3只F0代为转基因整合阳性鼠。结论成功制备了bcr—EGFP转基因小鼠，为进一步研究bcr启动子在CML转基因小鼠模型制备的安全性和可靠性提供线索和帮助。

绿色荧光蛋白转基因雄鼠肝细胞移植重建雌鼠的造血功能研究

目的用荧光雄鼠的肝细胞回输半致死量射线照射的C57BL雌鼠,观察肝细胞是否有重建造血功能的作用。方法用荧光雄鼠的肝细胞回输给半致死量射线照射的C57BL雌鼠,在移植后18、39和53 d剪鼠尾,采血并用CD4-PE和CD8-PE标记,再用氯化铵溶血,上流式细胞仪检测。移植87 d后杀鼠取骨髓用荧光原位杂交检测Y染色体阳性细胞的百分比,并取外周血、脾细胞、肝细胞和骨髓细胞检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞的百分比。结果回输肝细胞的雌鼠外周血中检测到GFP阳性细胞,同时检测到一部分GFP阳性细胞转化成了CD4+或CD8+T细胞,外周血中GFP阳性细胞的比例与荧光原位杂交分析的骨髓中的Y染色体阳性比例呈正相关。同时在鼠的脾细胞、肝细胞和骨髓细胞中都检测到了GFP阳性细胞。而脾细胞中检测到的GFP阳性细胞百分比高于其他细胞,相比有统计学意义(P=0.003)。结论成年鼠肝细胞含有一定量的造血干细胞,在移植鼠体内存活并分布在多脏器,重建了雌鼠的造血功能。

转绿色荧光蛋白基因小鼠子宫内膜异位症模型的建立和评价

目的建立小鼠子宫内膜异位症种植模型,探讨荧光检测异位子宫内膜的方法。方法将转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠的子宫内膜剪碎后,注射入C57BL/6小鼠的腹腔,喂养含17-β-雌二醇的无菌水,3周后剖检小鼠,在活体荧光成像系统下观察腹腔的绿色荧光,并做免疫组化染色。结果在移植转GFP基因小鼠子宫内膜的C57/BLC57BL/6小鼠的腹腔内存在绿色荧光,且免疫组化证实该异位内膜组织中表达GFP,而对照组均阴性。结论转GFP基因小鼠子宫内膜模型可清晰地显示异位内膜病灶,具有良好的应用前景。

慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白载体转染大鼠心肌成纤维细胞

目的探讨慢病毒-基质细胞衍生因子-1α-绿色荧光蛋白(LV-SDF-1α-GFP)对心肌成纤维细胞影响,最佳感染条件及目的蛋白表达和分泌特点。方法差速贴壁法分离培养乳大鼠心肌成纤维细胞,观察和免疫荧光鉴定。不同滴度及条件的LV-SDF-1α-GFP转染心肌成纤维细胞,观察荧光表达,探索最佳转染条件。LV-SDF-1α-GFP目的基因病毒以及阴性对照CON145病毒的转染心肌成纤维细胞,绘制生长曲线,探索转染对心肌成纤维细胞的增殖有无明显影响。利用最佳转染剂量组转染心肌成纤维细胞,斑点印迹法(Dot blotting)检测SDF-1α目的蛋白分泌。计量资料进行统计学分析。结果心肌成纤维细胞具很高活性,传至4代纯度高,折光度好,无自发性搏动。LV-SDF-1α-GFP最佳转染感染复数(MOI)值为10,添加感染增强液,聚凝胺组感染效果最好,效率达80%。LV-SDF-1α-GFP组以及阴性对照CON145组对心肌成纤维细胞毒性作用小,细胞形态无明显变化,与非转染组生长曲线相似,差异无统计学意义(P>0.05)。转染LV-SDF-1α-GFP的心肌成纤维细胞培养至第4天SDF-1α蛋白分泌量达最高值,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 LV-SDF-1α-GFP载体对心肌成纤维细胞具很高的转染效率,细胞毒性小,并能够分泌SDF-1α目的蛋白。

神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

【目的】为替换中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞。【方法】应用含碱性成纤维生长因子 (bFGF)的无血清培养技术 ,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞 ,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白 (nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白 (NF)和胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染目的细胞内。【结果】从海马组织分离的细胞具有分裂能力 ,能表达nestin。分化后一些细胞能表达NF ,而另一些细胞则表达GFAP。GFP基因修饰的细胞能发出荧光。【结论】从海马组织分离的细胞能表达nestin ,属于神经前体细胞 ,它们具有明显的增殖能力。有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞。GFP基因已成功转染到神经前体细胞内 ,并表达了GFP。

绿色荧光转基因大鼠模型的建立

目的随着干细胞研究的推进,大鼠干细胞的研究日趋迫切。本研究旨在为活体荧光影像系统、干细胞归巢、细胞移植体内示踪研究,提供绿色荧光蛋白EGFP转基因大鼠模型。方法通过显微注射方式获得EGFP转基因大鼠,采用活体荧光影像系统、激光共聚焦显微镜,对EGFP转基因大鼠各个组织的荧光表达水平进行比较;采用流式细胞术检测转基因大鼠血液和骨髓细胞、骨髓干细胞的荧光标记率,筛选骨髓干细胞高效标记绿色荧光的转基因大鼠。结果建立了心脏、肝脏、肌肉、肺、胰腺、脑、膀胱、胃、肾脏、肠和脾脏组织中,系统性表达EGFP的SD-TgN(ACT-EGFP-1)ZLFILAS转基因大鼠;流式细胞术检测表明,该品系血液细胞绿色荧光标记率为94.4%,骨髓干细胞绿色荧光标记率为97.8%。结论建立了多组织系统性高表达绿色荧光,骨髓干细胞荧光标记率高达95%以上的转基因大鼠,为影像分析,造血干细胞的归巢等研究提供了大鼠模型。

Nestin-GFP转基因小鼠睾丸中P75NTR表达的研究

目的:观察小鼠睾丸中的p75神经营养因子受体(P75NTR)的表达规律,并探讨其与巢蛋白(nestin)之间的关系。方法:通过免疫荧光技术观察出生后第5天Nestin-GFP转基因小鼠睾丸组织中的P75NTR和巢蛋白的表达位置,并采用实时荧光定量PCR和流式细胞分选方法检测P75NTR在不同周龄小鼠睾丸组织中的表达量;对分选得到的P75NTR阳性细胞在神经干细胞的培养液中进行培养,通过定向分化技术观察其神经分化能力。结果:免疫荧光染色结果显示P75NTR和巢蛋白定位表达于睾丸间质细胞。实时荧光定量PCR和流式细胞分选结果显示,P75NTR在出生第14天小鼠睾丸组织中出现表达高峰。出生后第5、14、30天小鼠睾丸中P75NTR阳性百分率分别为(2.88±0.52)%、(9.54±1.81)%、(2.63±0.43)%,分选得到的P75NTR阳性细胞也共定位表达巢蛋白和P75NTR,并且具有神经分化能力。结论:睾丸组织中P75NTR和巢蛋白共定位表达于睾丸间质细胞,该类P75NTR阳性细胞具有神经分化能力,推测其起源于神经脊。