胶原海绵复合新生大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织

目的:探索以胶原海绵为支架、新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,于体外构建工程化心肌组织的方法。方法:实验于2005-12/2006-11在解放军第四军医大学西京医院心内科实验室完成。Ⅰ型胶原海绵剪切成方形片状(2.0cm×1.4cm×0.2cm),经60Co照射消毒,于DMEM培养液中水化1h左右。另取1d龄SD大鼠心脏,剪成小碎块,然后用2.5g/L胰蛋白酶于37℃中消化,吸取上清至含胎牛血清的DMEM中,重复消化四五次,用差速贴壁法除去大部分成纤维细胞,将细胞沉淀用DMEM培养液以2×109L-1的密度悬浮备用。将上述的心肌细胞悬液1mL缓慢滴注于玻璃模型中的胶原海绵上,然后置于细胞培养中培养。肉眼及显微镜主要观察工程化心肌组织在培养期间的自发收缩情况,包括收缩的部位、强度、频率、一致性以及收缩随时间变化的情况。苏木精-伊红染色观察工程化心肌组织内胶原纤维的变化,细胞形态,胞核的形状及细胞之间的连接。免疫组织化学染色和透射电镜观察工程化心肌组织片的形态和功能。结果:①细胞接种于胶原海绵上1d后,细胞/胶原复合物的凝胶化过程基本完毕,体积保持恒定,维持至培养结束,第3天细胞/胶原复合物局部出现点片状自发收缩,第5天整个细胞/胶原复合物出现同步化自发收缩,收缩频率61～199次/min。2周后37.5%的工程化心肌组织的自发收缩活动减弱,但75%的工程化心肌组织的自发收缩活动持续至培养结束。②苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜显示,工程化心肌组织内细胞间连接广泛存在,细胞多呈纵向分布,胞核呈长圆形,胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性,胞内肌原纤维排列整齐,可见到心肌特异性的肌小节结构和Z线,多数细胞具有分化的心肌细胞表型。结论:用新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞、以Ⅰ型胶原海绵为支架材料,构建出的工程化心肌组织,于体外可长时间持续自发收缩,该细胞/胶原复合物的形态结构与生理功能均类似于成熟大鼠心肌组织。

体外构建工程化心肌组织的实验研究

目的探索以胶原海绵为支架,新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,于体外构建工程化心肌组织。方法用胰酶消化法分离新生大鼠心肌细胞,经初步纯化,然后接种于长方形片状胶原海绵中,将此细胞/胶原复合物置于细胞培养箱中,培养25 d,采用常规苏木精-伊红(HE)染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜等方法评价该工程化心肌组织片的形态和功能。结果构建的工程化心肌组织片先是出现局部自发收缩,随时间延长,自发收缩区域增多、强度增大,整个心肌片出现同步收缩,此收缩活动可持续25 d。检测结果显示,工程化心肌组织内细胞间连接广泛存在,细胞多呈纵向分布,胞核呈长圆形;多数细胞胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性;细胞间连接清晰可辨,细胞内的肌原纤维排列整齐,可见到肌小节结构和Z线。结论用新生大鼠原代心肌细胞作为种子细胞、胶原海绵为支架,于体外可构建组织形态与生理功能类似于成熟大鼠心肌组织的工程化心肌组织。

力学刺激在工程化心肌组织结构和功能改建中的作用研究

目的探索力学刺激在工程化心肌组织结构和功能改建中的作用。方法将分离并培养的新生大鼠心肌细胞与添加了Matrigel的液态Ⅰ型胶原混合,在环形槽中铸成环状心肌细胞/胶原条带。构建的条带在环形槽中培养7天后取出,在对其施加10%的静态拉伸力的情况下,再培养7天。通过光学显微镜、常规HE染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察等对构建的组织工程化心肌组织进行评价。结果工程化心肌组织在力学刺激组的第2天可观察到局部跳动的区域,随时间的延长跳动的区域逐渐增多,强度逐渐增大,并最终形成一致跳动。而对照组未经力学拉伸刺激的工程化心肌组织则未能形成一致跳动。组织学和免疫组织化学染色研究结果显示,构建的工程化心肌组织经力学刺激,心肌细胞比较均匀地分布在整个条带中,且多数沿拉伸方向伸展,胞核呈长梭形,其形态类似于天然成熟心肌组织。透射电镜观察显示,条带中心肌细胞含有排列整齐的肌原纤维,并沿着细胞的长轴方向伸展,肌小节结构和Z带清晰可见。结论力学刺激可以更好地促进工程化心肌组织的结构和功能改建,使其更接近正常心肌组织。

体外构建组织工程化心肌片层的实验研究

探索以液态胶原作为支架材料,体外构建组织工程化心肌片层的可行性。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶分离新生大鼠原代心肌细胞,然后与Ι型胶原M、atrigel和2×DMEM混合,注入方形模具内,制备心肌细胞-胶原复合体,体外培育1周后,施加外力,拉伸刺激条件下继续培养1周。通过光学显微镜下观察H、.E.染色、激光共聚焦和透射电镜观察等对构建的组织工程化心肌片层进行评价。结果表明:心肌片层在培养的第2天出现自发性的跳动,随时间的延长,跳动的区域逐渐增多,并于外力拉伸后的第4天形成一致跳动。激光共聚焦研究结果表明:在构建的工程化心肌组织中,肌原纤维显示排列有序,多数沿拉伸方向伸展,其形态类似于心肌组织。电镜观察显示:拉伸的心肌片层中的心肌细胞含有较多的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。采用新生大鼠心肌细胞与液态Ι型胶原复合方式,可在体外再造出片层状心肌组织,构建的组织工程化心肌片层具有与心肌组织类似的结构和特性。

心肌组织工程支架材料:从研究到应用还有多远?

目的:寻求在心肌组织工程中,能为培养的种子细胞提供可靠的仿生型心肌细胞外基质材料。方法:应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中1996-01/2007-08关于组织工程支架材料的文章。结果:具有良好的生物相容性和机械性能的天然生物支架材料是心肌组织工程支架快速成形技术的首选材料。天然生物材料如胶原、壳聚糖等机械性能较差,可塑性不强,但生物相容性好,可用于心肌支架的快速成形。三维打印、激光烧结、立体印刷技术、选择性激光烧结快速成形技术制备出的支架均具有高的孔隙率,高的表面积体积比,孔与孔之间完全通透,宏观形状可控,孔隙率和孔径独立控制等优点。结论:采用离散/堆积成型原理,利用计算机和纳米高分子技术等高科技,结合传统心肌组织工程支架生物材料,对生物材料应用表面修饰或改性技术,有望为心肌组织工程提供较理想的支架材料。

心肌组织工程的研究现状

心肌组织工程的目的是通过在体外构建理想的心肌组织工程 ,用于替代和修复病损的心肌组织。从心肌组织工程的细胞来源、细胞培养基、细胞接种、细胞支架、生物反应器

心肌组织工程研究现状

组织工程包括种子细胞、生物材料和组织构建三部分。种子细胞的来源和种类是心肌组织工程的关键环节,目前研究较多的主要有胎幼心肌细胞、心脏自体细胞和全、多能干细胞等。生物材料是细胞附着的基本框架和代谢场所,直接影响所构成的组织形态和功能。生物反应器系统使体外构建理想的工程化心肌组织成为可能。本文介绍近年来心肌组织工程在上述三方面的研究进展。

心脏脱细胞基质在心肌组织工程中的应用

近年来,心脏脱细胞基质材料成为心肌组织工程领域炙手可热的明星,其低致敏性和最接近天然的三维结构显示了其在修复、替代坏死心肌和器官再造方面的广阔应用前景。本篇综述着眼于心脏脱细胞基质在心肌梗死治疗以及全器官再造等方面的研究,从心脏脱细胞基质的制备、检测和应用方面进行了系统回顾,并探讨该材料今后的应用前景与方向。

智能化水凝胶在原位心肌组织工程的应用

原位心肌组织工程在近年取得了突飞猛进的发展,它是指利用生物材料携带细胞移植于心肌梗死及其周边部位防治心肌梗死后心力衰竭,为细胞治疗提供了基质,提高了细胞的存活率,现就生物材料可注射水凝胶在原位心肌组织工程的应用作一综述。

心肌细胞与胶原材料复合再造组织工程心肌移植心肌梗死大鼠的心肌电生理变化

背景:组织工程化心肌组织移植可修复大鼠心肌梗死。目的:应用微电极阵标测技术分析心肌细胞与胶原材料复合组织工程再造心肌移植心肌梗死大鼠的心肌电生理特性。方法:将成年SD大鼠随机分组:假手术组、模型组、移植组。后2组制作心肌梗死动物模型,假手术组仅开胸不结扎冠状动脉,移植组造模后移植心肌细胞与胶原材料复合组织。应用微电极阵标测技术记录心室肌场电位振幅,激活-恢复时间及激动传导时间。结果与结论:①心室肌场主波振幅:与模型组相比,移植组梗死区、对立区及周围区部位增高(P<0.05)。②激活-恢复时间:模型组与移植组梗死区与梗死周边区均明显延长,且梗死周边区小于梗死区(P<0.05)。与模型组相比,移植组梗死区、对立区及周围区部位激活-恢复时间缩短(P<0.05)。③心室前壁激动传导时间:移植组高于假手术组,但低于模型组(P<0.05)。表明移植的心肌细胞/胶原复合体能改善心肌梗死大鼠心室肌收缩功能及电传导时间,部分修复心脏功能。

心肌组织工程研究进展

冠心病是现代社会危害公众健康的主要疾病之一,而现有的治疗手段并不能从根本上治愈冠心病所引起的心肌损害和心功能下降,心肌组织工程概念的提出有望为解决这一难题提供新途径。本文结合近年来的文献对心肌组织工程的国内外研究进展作一综述。

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织

背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化。目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周。将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14d。以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构。结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长。免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ。透射电镜可见肌丝、Z线样物质。结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织。

应用MEA技术研究组织工程再造心肌对心梗大鼠心室肌电传导功能的影响

目的:应用微电极阵标测技术(MEA)研究组织工程再造心肌移植心梗大鼠的心肌电传导功能。方法:将成年SD大鼠30只随机分为假手术组、心梗组、移植组。应用MEA技术记录心室肌场电位的形态和激动传导时间。结果:正常大鼠心室除极波形多为三向波,呈RS、rSR’型。心梗组心梗面以QR或qR为主,R波圆钝;心室对立面及梗死周围面以R波为主。移植组心室心梗面主要以QR或qR为主,对立面及梗死周围区以Rs或R波为主。测量大鼠心室前壁、后壁及游离壁激动传导时间。假手术组为(6.5±2.12)ms、(11.25±1.77)ms和(7.05±0.78)ms;心梗组为(17.5±3.54)ms、(12.5±2.12)ms和(10.5±2.12)ms;移植组为(9.13±1.31)ms、(10.25±0.35)ms和(8.25±0.35)ms。与心梗组相比,移植组激动传导时间明显缩短(P<0.05)。移植组和假手术组心梗面和周围面激动传导时间明显低于心梗组(P<0.05)。结论:心肌细胞/胶原复合体可改善心梗组织的电传导功能。

心肌组织工程种子细胞的研究进展

目的综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题,并展望其前景。方法广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献,并进行综述。结果心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景,但还处于起步阶段,仍然需要通过大量的实验找到最佳的细胞来源。结论组织工程心肌有广阔潜在的临床应用前景,其细胞来源值得进一步研究。

用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的研究

目的探索用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的方法。方法用胶原、M atrigel、2倍DMEM分别与含0.04%EDTA的0.25%胰酶制备的乳鼠原代心肌细胞(实验组)和0.1%胰酶制备的原代心肌细胞(对照组)混合,注入环形槽内形成心肌条带,一周后行力学拉伸继续培养一周。常规HE染色等对组织工程化心肌组织,即心肌条带进行评价。结果心肌条带出现自发性跳动,HE染色显示与正常成年大鼠心肌组织类似,电镜结果显示条带中的心肌细胞含有丰富的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶制备的原代乳鼠心肌细胞构建的心肌条带,拉伸后第4天形成一致性跳动。免疫组化检测提示肌钙蛋白阳性细胞数多于对照组。电镜观察显示,条带的心肌细胞中肌原纤维较对照组明显增多。结论这一方法可构建工程化心肌组织,心肌细胞制备方法的改进以及液态Ⅰ型胶原浓度的精确测定,可显著提高构建心肌条带的成功率及条带的生理功能,使其更接近正常心肌组织。

基于成体干细胞体外构建组织工程化心肌

缺血性心脏病导致的心力衰竭是一个全球性的问题，如何治行这些患者仍是一个无法解决的难题。与心脏瓣膜和血管不同，心肌尚无可替代的人工材料。随着体外细胞培养技术的成熟以及组织工程概念的提出，运用细胞修补心脏成为一种令人兴奋的新治疗概念。但是，对于需要进行大面积心肌修补的患者而言，单纯点状移植的细胞较难以在较大面积的无血供区域存活。所以继细胞移植之后，体外构建组织工程化心肌已成为心肌组织工程领域最富有挑战性的目标。

心肌样细胞和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物在体内构建工程化心肌组织

目的探索以骨髓间充质干细胞(BMMSCs)诱导分化的心肌样细胞为种子细胞、以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)作为支架材料,在大鼠体内构建工程化心肌组织的可实施性。方法分离培养大鼠BMMSCs,取第3代细胞用5-氮胞苷和血管紧张素Ⅱ联合诱导24 h继续培养3周,将诱导分化的心肌样细胞种植到PLGA支架上形成移植物,在孵箱里孵育3 d,然后将其移植到预先制备好的大鼠腹膜腔囊袋之中。4周以后,取出移植物并采用HE染色观察心肌样细胞的形态特征、用免疫组织化学染色法检测工程化心肌细胞肌钙蛋白(c Tn) I的表达、透射电镜下观察心肌样细胞的形态和结构。结果 HE染色结果显示,在PLGA支架上可见到梭形的细胞核,且心肌样细胞分布均一;免疫组织化学染色结果显示PLGA-心肌样细胞组绝大多数移植细胞表达心肌特异性蛋白c Tn I;透射电镜观察显示,在体内构建的工程化心肌组织中,可以看到肌丝沿细胞的长轴平行排列,胞浆中富含大量的线粒体和内质网,以及桥粒结构、缝隙连接和Z线样物质。结论成功的建立了在大鼠体内构建工程化心肌组织的方法。这种体内微环境有助于移植组织或细胞的存活,在大鼠体内构建的工程化心肌组织具有与天然心肌组织相似的结构。