组织工程皮肤血管化策略及研究进展

组织工程皮肤作为皮肤缺损治疗的替代解决方案,其核心思想是利用支架、种子细胞或者生物活性分子来促进皮肤的修复重建。在过去几十年里,该领域发展迅速,各种改善皮肤再生的策略层出不穷。然而,尽管有诸多组织工程皮肤产品已经被商业化生产并应用于临床,但仍存在诸多问题需要进一步研究解决。其中,组织工程皮肤的血管化是关键挑战之一。目前,已有大量基础研究致力于解决组织工程皮肤的血管化难题,可以分为两大类,即基于各种生长因子、种子细胞或活性纳米颗粒的促血管生成策略,以及基于组织工程皮肤支架的体内、外预血管化策略。本文将从上述两个方面分别概述其促进组织工程皮肤血管化的优缺点,并介绍最新进展。

构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究

目的 探讨运用组织工程方法构建含有黑色素细胞的组织工程皮肤。 方法 以包皮组织作为细胞来源 ,采用消化法获得角朊细胞、成纤维细胞和黑色素细胞 ,在自行设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。行Dopa染色、透射电镜和 S- 10 0免疫组织化学检测构建的皮肤中黑色素细胞的分布和状态。 结果 构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,Dopa染色、透射电镜和 S- 10 0免疫组织化学检测均显示含有大量黑色素细胞并处于良好状态。 结论 构建了含黑色素细胞的组织工程皮肤 ,可用于下一步的动物实验和临床实验。

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的移植研究

目的 探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。 方法 应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤 ,对裸鼠大面积 (直径 2 0 mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。 2 4只 8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植 (AS)组、壳多糖膜覆盖物 (CH)组及对照组 ,术后进行大体观察 ,并在 3、7、14和 2 1天应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监测。 结果 AS组在移植第 3天 ,组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合 ,有少量毛细血管长入移植物 ,皮肤移植物颜色与自体皮肤颜色接近 ;随着时间的延长 ,移植物中毛细血管的数量逐渐增多 ,表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层 ,角化征象加强 ,有角化物脱落 ;真皮层细胞数量增多 ,网架逐渐降解 ,分泌的细胞外基质成分增多 ;第 14天 ,创面基本愈合 ,修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近 ,瘢痕小 ,无需进行二次植皮。CH组至移植第 14天 ,结痂未完全脱落 ,创面未愈合 ,颜色较 AS组深 ;第 2 1天创面愈合 ,遗留较大瘢痕 ,与正常皮肤区分明显 ,而对照组的结痂脱落 ,创面大而深 ,颜色深红。 结论 以壳多糖为基质网架构建的组织工程化皮肤具有良好的组织相容性 ,可应用于皮肤缺损的移植修复。

构建含血管结构的组织工程皮肤的研究

目的 探讨应用组织工程方法构建含有血管结构的组织工程皮肤。 方法 以新生儿脐带静脉和包皮作为细胞来源 ,用消化法获得血管内皮细胞、皮肤角朊细胞和成纤维细胞 ,用设计的组织工程皮肤培养系统构建组织工程皮肤。实验组 :真皮层含有 1∶ 1的成纤维细胞和血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮 ;对照组 :真皮层只含有成纤维细胞 ,不含血管内皮细胞 ,在真皮表面种植角朊细胞以形成表皮。 HE染色和免疫组织化学染色检测第 因子抗体 ,观察两种组织工程皮肤真皮层中血管结构的形成情况。用所构建的两种组织工程皮肤修复裸鼠的全层皮肤缺损。 结果 所构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,实验组真皮层内含有血管样结构 ,对照组未见到血管样结构。修复裸鼠全层皮肤缺损 ,肉眼观察皮肤缺损愈合 ,染色显示移植部位有大量血管长入。 结论 构建的组织工程皮肤结构完整 ,细胞状态良好 ,真皮层中形成了微血管样结构。

组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养。将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5mL与纤维蛋白支架(0.5mL)混合凝固构建组织工程皮肤。取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3g,平均20.0g,制备背部全层皮肤缺损模型。随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤。术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察。结果?细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞。构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞。移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻。术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为:(0.460±0.049)、(0.480±0.055)、(0.540±0.043)、(0.510±0.032)及(0.660±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P<0.05)。术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见。结论用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤。

以HaCaT细胞为种子细胞构建新型人组织工程皮肤

目的:评估以人永生化角朊细胞HaCaT为种子细胞构建新型人组织工程皮肤的可行性。方法:对HaCaT进行无血清培养(DK-SFM)及传代培养;取处于对数生长期的细胞进行接种;利用物理化学方法,采用SD大鼠网状层真皮制备(Acelluar dermal matrix,ADM);应用MTT比色法作生长曲线观察HaCaT细胞长满真皮支架所需时间。HE染色法观察脱细胞前后真皮支架和细胞单层及初步形成的细胞多层。结果:脱细胞真皮的细胞成分消失,组织疏松,为理想的组织皮肤支架;将HaCaT细胞按2×10~5/cm^2密度接种到ADM上,细胞长满支架的时间为5天。

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景:利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题,但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。目的:以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质,拟构建活性组织工程皮肤。设计、时间和地点:以基因工程为基础的组织构建实验,于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。材料:普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料,由南昌大学医学院动物科学部提供,人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者,pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。方法:无菌条件下切取兔耳全层皮肤,将2cm×2cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮,再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净,磷酸盐缓冲液反复清洗,即为脱细胞真皮基质,4℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,按5×105/孔密度接种,待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染,接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。主要观察指标:骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察,组织工程皮肤结构观察。结果:体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形,基因转染后细胞形态及活性无明显影响;脱细胞真皮基质呈瓷白色,柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2d后,所构建的组织工程皮肤呈淡红色,质软,接种细胞生长状态正常,苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。结论:血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好,可在体外联合构建活性组织工程皮肤。

天狼猩红-偏振光检测组织工程皮肤中胶原的观察

目的研究组织工程皮肤中胶原合成及分泌情况,并与正常皮肤对照。方法采用苦味酸-天狼星红染色,偏振光显微镜观察,Photoshop半定量分析,观察Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量。结果正常皮肤和组织工程皮肤的真皮中都有Ⅰ、Ⅲ型胶原,在正常皮肤的真皮中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量分别是98.51±11.28、33.93±3.90;培养成熟的组织工程皮肤中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量分别是91.42±3.82、30.75±2.29,二者相比差异无统计学意义(P>0.05)。组织工程皮肤培养8、15、30d,组织内Ⅰ型胶原分别为50.75±4.22、63.57±6.87、91.42±3.82,Ⅲ型胶原分别为16.90±1.64、23.65±4.08、30.75±2.29,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论(1)培养成熟的组织工程皮肤与正常人皮肤中胶原含量及分布无明显差异;(2)组织工程皮肤不同的培养时期胶原的含量及种类有明显差异。

复合骨髓间充质干细胞的组织工程皮肤治疗慢性难愈性溃疡探讨

目的探讨复合骨髓间充质干细胞(MSCs)的组织工程(TE)皮肤在修复皮肤缺损中的疗效,为临床治疗类似疾病提供新方法。方法利用组织工程学方法,以牛胶原为支架,自体MSCs为种子细胞,构建TE皮肤。对1例双下肢溃疡15年的患者进行移植治疗,观察疗效。结果移植后1周溃疡边缘变平,健康的肉芽组织形成,2周后皮岛扩大,边缘形成了较薄的上皮组织。4周后溃疡面积缩小40%,9周后溃疡面积缩小90%。结论构建的复合骨髓间充质干细胞的组织工程真皮移植后,提高了愈合速度,获得了较理想的创面愈合效果。为临床治疗类似溃疡型疾病提供了新的治疗思路。

龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损的作用

【目的】观察龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤缺损创面的促进作用。【方法】将人成纤维细胞种植入胶原海绵,人角质形成细胞种植在表层,构建组织工程皮肤,并移植入裸鼠皮肤缺损创面;实验动物随机分为4组,选用"活血圣药"龙血竭于移植后2d分别进行创面外敷、单纯口服、创面外敷+口服治疗,并设空白对照组。组织工程皮肤移植后9d取材检测,观察创面局部表皮厚度、真皮层中层粘连蛋白(Ln)、Ⅰ型胶原蛋白的表达及毛细血管增生情况。【结果】龙血竭能促进组织工程皮肤移植后表皮的发育及真皮层中毛细血管的增生,增强Ln、Ⅰ型胶原蛋白的分泌,龙血竭外敷+口服组效果最佳。【结论】龙血竭对组织工程皮肤修复皮肤创面有促进作用。

组织工程皮肤治疗糖尿病足溃疡的Meta分析

目的系统评价组织工程皮肤(tissue-engineered skin,TES)治疗糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer,DFU)的效果。方法计算机检索Cochrane图书馆、PubMed、EMbase、CBM、CNKI、VIP,手工检索有关引用文献,收集以TES为干预措施治疗DFU的随机对照试验(RCT),按Cochrane系统评价方法,评价纳入研究的方法学质量并提取有效数据进行Meta分析。结果共纳入7个RCT,包括880例DFU患者。Meta分析结果显示:在试验的12周中,与保守治疗(conventional treatment,CT)相比,TES明显促进了DFU愈合[OR=1.88,95%CI(1.41,2.51)];在不良反应方面,TES能降低DFU的感染机会[RR=-0.04,95%CI(-0.06,-0.01)]。有2项试验对DFU复发进行了分析,提示两组无明显差异。结论与保守治疗相比,TES能显著促进DFU愈合,并可降低DFU溃疡面与并发周围组织感染的机会。

培养基钙浓度对复方壳多糖组织工程皮肤基底膜构建的形态学研究

目的寻找最适于组织工程皮肤生长及基底膜构建的体外培养基钙浓度。方法按照鲁元刚等建立的方法制备复方壳多糖组织工程皮肤,根据培养基钙浓度不同,分为1.00、1.45、1.65和1.95mmol/L四组。在37℃、5%CO2及90%以上湿度孵箱内浸没培养3d后,将培养物置于不锈钢筛网上进行气-液界面三维培养,每天换液1次。培养7、15d,行HE、PAS染色观察组织工程皮肤的组织学特性;并利用免疫组织化学染色对基底膜的主要成分——型胶原进行观察,评价基底膜构建情况。结果各组组织工程皮肤组织学观察类似正常皮肤,有分化良好的表皮和致密真皮,但1.95mmol/L组表皮分化较其他组更好;1.00、1.45及1.65mmol/L组角化层外侧常伴未角化的角质形成细胞,1.95mmol/L组表皮细胞角化完全,且与颗粒层细胞结合牢固。PAS染色显示各组真、表皮间有紫红色带状结构;免疫组织化学染色显示真皮与表皮间型胶原反应呈阳性,且1.95mmol/L组阳性反应强于1.00mmol/L组。结论钙浓度为1.95mmol/L的培养基最适合于复方壳多糖组织工程皮肤生长及基底膜构建。

复合型组织工程皮肤的体外快速构建

目的寻找一种体外快速构建复合型组织工程皮肤的方法,为大面积烧伤、创伤创面的覆盖提供足够的自体皮源。方法取人的包皮,进行表皮细胞及成纤维细胞的分离鉴定及体外培养扩增,对表皮细胞群行广谱角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、角蛋白19（cytokeratin19,K19）-FITC免疫荧光染色及K19流式细胞仪鉴定;对成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光鉴定。将表皮细胞接种于异体脱细胞真皮（acellular dermalmatrix,ADM）乳头面,于气-液平面培养构建表皮层,实验分两组进行,实验组培养基中添加25ng/ml角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）,对照组不添加。6d后,接种成纤维细胞于两组ADM的另一面,继续培养24h。收集构建的组织工程皮肤,切片行苏木素-伊红染色,观察所构建皮肤的镜下结构,并对比添加KGF对其影响。结果免疫荧光染色培养扩增的表皮细胞群广谱角蛋白抗体-FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性,流式细胞仪鉴定其中K19阳性表达的细胞接近17%。成纤维细胞体外培养7d可扩增超过100倍,波形蛋白-FITC免疫荧光染色呈阳性。经过7d的体外培养构建,可以得到复合型皮肤,经苏木素-伊红染色镜下观察显示,实验组表皮层连续,形成细胞层数2-3层的复层结构,真皮中含有成纤维细胞;对照组表皮层不连续,细胞层数少,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法进行种子细胞的分离,应用添加KGF的条件培养基,采用分步接种构建的方法,可在7d内构建出复合型组织工程皮肤。

组织工程皮肤分泌细胞因子的初步研究

目的 研究组织工程皮肤培养液中IL 1β、IL 6和IL 8的分泌情况。方法 收集组织工程皮肤制备过程中单层成纤维细胞(fibroblast ,FB)培养液、胶原凝胶真皮替代物(dermalequivalent,DE)、复合壳多糖DE和复合壳多糖皮肤替代物(skinequivalent,SE)培养液标本,ELISA法检测其中IL 1β、IL 6和IL 8分泌量。结果 复合壳多糖真皮基质促进FB、角质形成细胞(keratinocyteKC)分泌IL 6、IL 8。SE分泌的IL 6、IL 8在DE加KC之后和SE形成分层表皮时形成两个高峰。结论 FB、KC在壳多糖组织工程皮肤中混合器官型培养时分泌IL 6和IL 8较明显,这些细胞因子可在创面愈合中发挥重要作用。

化学腐蚀性组织工程皮肤检测模型的构建

利用组织工程学方法,以牛I型胶原为支架,人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞为细胞来源,构建化学腐蚀性检测用组织工程皮肤模型。选用欧洲替代方法验证中心(the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods,ICCVAM)制定的体外测试化学品腐蚀性最小执行标准中的8种化学品为检测物质。在检测实验中,8种化学品(固体10mg、液体25μl)分3min、1h局部接触组织工程皮肤模型表面,MTT方法测定细胞活力,相对细胞活力值作为判定腐蚀性的标准。结果表明,构建的组织工程皮肤检测模型结构完整,含有基底层、棘层、颗粒层和角质层,能准确判断7种化学品的腐蚀性。构建的组织工程皮肤模型可以作为检测工具用于化学品腐蚀性的检测。

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的:改良传统人表皮干细胞(hESCs)分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法:应用改良的酶消化法(改良法)及传统酶消化法(传统法)分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19(K19)和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果:台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个(P<0.01);改良法活细胞比率是(94±0.01)%,传统法活细胞比率是(75±0.04)%(P<0.05)。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19(K19)和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论:利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。

骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建组织工程皮肤修复糖尿病皮肤缺损

背景:小肠黏膜下层已经被证实可以引导许多组织的特异性再生。目的:将骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤并移植修复兔糖尿病皮肤缺损,观察其对糖尿病皮肤缺损的愈合影响和疗效。方法:制作兔糖尿病皮肤缺损,将骨髓间充质干细胞与冻干、灭菌、水合后的猪小肠黏膜下层膜复合制作组织工程皮肤并覆盖修复兔糖尿病皮肤缺损,并与小肠黏膜下层支架组和空白对照组做对照。结果与结论:造模后1,2,4周,组织工程皮肤组缺损皮肤修复面积百分比显著大于小肠黏膜下层支架及空白对照组(P<0.05)。缺损皮肤修复组织观察组织工程皮肤组组织生长明显快于小肠黏膜下层组与空白对照组。3组均未见明显皮肤附件结构。表明骨髓间充质干细胞复合猪小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤修复兔糖尿病皮肤缺损好于单纯小肠黏膜下层膜,无明显瘢痕组织的生成,可作为支架材料用于皮肤缺损的修复。

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异。方法Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HaCaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermalequivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异。结果以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性。以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差。两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7d各检测时相点间有显著性差异(P<0.05)。结论ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤。

组织工程皮肤的结构和特性

人体组织和器官的结构是其功能的基础。人体皮肤丢失的同时也丧失了其相应的功能。当皮肤缺失面积相当大时,用自体皮来封闭皮肤缺损创面就存在皮源不足的问题。而组织工程研究的进展,使应用人工皮肤来修复皮肤缺损成为可能。为了使研制出的组织工程皮肤的功能与正常皮肤接近甚至相同,在结构上,也应使它们尽可能地接近与相似。本文就表皮替代物、真皮替代物、复合人工皮肤的构建及其特性和应用作一综述。相信随着多学科的发展和基础与临床研究的深入,制备的组织工程皮肤替代物在结构与特性上将更接近正常皮肤。

酮洛芬及其异丙酯对HaCaT细胞构建的组织工程皮肤的渗透作用

目的体外构建适用于经皮给药研究的组织工程皮肤。方法以表皮角质形成细胞系HaCaT细胞及人真皮成纤维细胞为细胞来源,用I型牛胶原蛋白为真皮基质包埋成纤维细胞,其上接种HaCaT细胞,采用气液界面方式培养,观察不同的培养介质对组织工程皮肤的影响,HE染色切片观察培养皮肤结构形态。以酮洛芬及其异丙酯为模型药物研究经皮渗透和代谢特性。结果HaCaT细胞经气液界面培养可形成类表皮层,但不能形成完整的角质层。维生素C可明显促进细胞增殖,维生素D3可促进细胞分化,雌二醇对此组织工程皮肤没有明显的影响。同皮肤细胞匀浆代谢相似,酮洛芬异丙酯被代谢成原药酮洛芬。结论HaCaT细胞在气液界面培养条件下可形成多层分化不完全的表皮层,保留了一定的酶活性,可用于药物的经皮渗透和代谢等研究。