CHO工程细胞株低血清培养的初探

以DMEM∶F12(1∶1)为基础培养基,对CHO细胞的低血清培养进行了初步探索,降低培养基中血清含量,观察了细胞在10%、5%和1%等不同浓度低血清培养条件下生长状态和外源蛋白表达活性的变化。试验结果表明:在含1%血清的F12∶DMEM(1∶1)培养基中,细胞仍能保持良好的生长状态,且培养上清中的目的蛋白活性与常规血清浓度10%DMEM培养条件下的活性接近。从而达到了既可以降低生产成本,又可以降低纯化难度的目的。

反义RNA逆转耐药肝癌基因工程细胞株多药耐药性的实验研究

目的通过重组腺病毒表达出mdr1基因的反义RNA,观察反义RNA对人肝癌基因工程细胞株HepG2/R多药耐药性的逆转效应。方法利用真核表达载体构建可以稳定表达mdr1基因和P糖蛋白的肝癌基因工程细胞株HepG2/R,通过腺病毒载体AdEasy系统生成重组腺病毒pAd Easy-GFP-ASmdr1,将此病毒感染HepG2/R,用RT-PCR检测mdr1 mRNA的表达强度,流式细胞仪检测细胞膜P-糖蛋白的表达和柔红霉素的蓄积率,HepG2/R细胞对阿霉素的耐药性用MTT法检测。结果HepG2/R细胞感染重组腺病毒后,RT-PCR检测表明mdr1 mRNA表达下降,流式细胞仪检测证实P-gp表达下降和柔红霉素的蓄积率增加,MTT法表明HepG2/R细胞对阿霉素的IC50从25μg/mL下降到3μg/mL。结论反义RNA通过抑制mdr1mRNA和P-gp的表达。

人源受体hGPCRc工程细胞株的建立及其应用

目的建立孤儿G蛋白偶联受体(OrphanGproteincoupledreceptors,oGPCRs)配基筛选体系并应用于化合物的筛选。方法利用RTPCR从人结肠组织获得oGPCR成员hGPCRc的氨基酸编码序列,在利用相关软件对hGPCRc的结构特点进行分析的基础上,构建hGPCRc之表达载体pcDNA3.1(+)hGPCRc,转染CHOK1细胞获得CHOhGPCR工程细胞株,将不同化合物作用于细胞株,用Fluo3为分子探针检测细胞内钙离子浓度变化,以分析化合物中是否为该受体的特异性配基。结果生物信息学分析得到:hGPCR定位于人染色体13q32.2,对应的氨基酸序列组成了7个跨膜区段的结构域,在进化树上与人源P2Y1受体最亲近,应属于人类GPCR成员;成功得到CHOhGPCRc工程细胞株;所检测化合物作用于细胞株并没有引起胞内钙离子的波动,很可能没有活化hGPCRc。结论hGPCRc是一个与已知人P2Y1最近的成员,但基于CHOhGPCRc工程细胞株的第二信使筛选结果表明,hGPCRc并不被P2Y1的已知配基活化因此很可能属于不同于P2Y1的嘌呤类受体新亚型。

人孤儿受体GPR81分子克隆、组织分布及表达工程细胞株的建立

采用PCR技术分别从人全血基因组DNA及引产胚胎肾组织cDNA中扩增得到gpr81的全长cDNA序列(1041bp),运用生物信息学手段绘制该基因的分子进化树,显示该基因的氨基酸序列与烟酸受体同源性最高;然后,采用RT-PCR法分析该基因表达的组织分布,组织表达谱显示该基因在多种组织均有表达,以心脏及肝脏组织为最高;利用分子克隆手段构建含6×组氨酸(His)标签蛋白的真核表达载体pcDNA3·1(-)/his-myc-A-gpr81,通过脂质体介导,将该重组质粒转染CHO-K1细胞,RT-PCR证实该基因已整合入CHO-K1细胞的基因组中,Western-blot表明GPR81在CHO-GPR81工程细胞株中有表达。组织表达谱的检测和工程细胞株的建立为进一步研究该受体的生物学功能奠定了基础。

野生型组织型纤溶酶原激活剂工程细胞株生物学特性分析

组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）是体内丝氨酸类蛋白酶。它能激活纤维蛋白溶酶原生成纤溶酶，后者将不溶性的纤维蛋白降解为可溶性肽段，使血栓溶解，血管再通。而且由于它与纤维蛋白有高亲和力，只激活血栓表面纤溶酶原，溶解局部血栓，因而引起全身出血倾向小。目前，...

CHO-hGPR91工程细胞株的构建及鉴定

目的构建携带hGPR91蛋白表达序列的pcDNA3.1(+)-hGPR91表达载体,并将其转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中,经筛选获得CHO-hGPR91工程细胞株,并对工程细胞株表达受体功能进行初步鉴定。方法采用PCR法扩增hGPR91全长开放阅读框,通过T4连接酶将其连接到载体pcDNA3.1(+)上,再通过Lipofectamine 2000将重组载体转染入CHO细胞中,并以抗生素G418加压筛选,RT-PCR及Western印迹法检测工程细胞株中hGPR91 mRNA及蛋白的表达情况,以Fluo4-AM荧光染料检测琥珀酸对细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响。结果所构建CHO-hGPR91工程细胞株能够成功表达hGPR91的mRNA及蛋白,在琥珀酸的刺激下能够明显引起工程细胞株[Ca2+]i的变化;而空载体pcDNA3.1(+)转染CHO细胞所得的CHO-pcDNA3.1(+)细胞则无上述效应。结论成功构建了CHO-hGPR91工程细胞株,琥珀酸作为GPR91的特异性配体,能够明显改变工程细胞株的[Ca2+]i,为进一步研究GPR91的功能及针对以GPR91为靶点的药物研发奠定了基础。

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10^(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。

11G工程细胞株人尿激酶原(pro-UK)基因拷贝数的测定

采用Southernblot和狭缝（Slotblot）杂交的方法，对高效表达人尿激酶原（pro-UK）的工程细胞──11G原代细胞及传134代后细胞含有的pro-UK基因拷贝数进行了测定。结果显示，11G工程细胞株内所含的pro-UK的拷贝数为100—200拷贝／细胞，传134代后其拷贝数基本不变，说明11G细胞株是稳定高表达pro-UK的工程细胞，符合WHO规定的关于重组DNA转化细胞用于生产的要求。

人红细胞生成素工程细胞株的特性鉴定

目的 :为了对人红细胞生成素工程细胞株 (F10 - 6 )进行特性鉴定。方法 :将人红细胞生成素基因构建的重组表达质粒pCDB与标志质粒pSV -dhfr共转染CHO -dhfr- 细胞中 ,经氨甲喋呤加压筛选和亚克隆挑选 ,获得高效稳定表达EPO的工程细胞株并对其进行鉴定。结果 :实验结果表明 ,工程细胞株无细菌、支原体、真菌和病毒污染 ;并无致瘤性 ;染色体数目不变 ;连续传代5 0次和三次冻存复苏后 ,细胞表达稳定。结论 :该工程细胞株可用于工业化生产。

野生型组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)工程细胞株生物学特性分析

野生型t-PA工程细胞4B3形态与亲代细胞CHO-dhfr-相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压达5×10^(-7)mol/L时,少数细胞略变瘦长,但仍显多角形,形态正常。细胞无血清培养上清经FAPA检测,亚克隆株表达水平为10~6细胞4000～5000IU/24h。细胞经体外传代3个月及冻存3个月后复苏,部分亚克隆株表达水平下降,多数仍为10~6细胞4000IU/24h,表明4B3细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的4B3rt-PA均无致瘤性病毒,支原体检查为阴性。遗传特性分析表明,该工程细胞与其亲代细胞CHO-dhfr-细胞染色体数均为20条,均有不同程度不同类型的畸变。该工程细胞的畸变率为16％。CHO-dhfr-细胞畸变率为6％。属正常范围。结果表明4B3细胞株为高效表达的性能优良的工程细胞株。

11G工程细胞株人尿激酶原基因拷贝数的测定

采用DNA印迹和狭线印迹(Slot blot)的方法,对高效表达人尿激酶原(Pro-UK)的工程细胞11G含有的pro-UK基因拷贝数进行了测定。结果显示,11G工程细胞株内所含的pro-UK拷贝数为100～200/细胞。结果证明,11G细胞株是稳定高表达pro-UK的工程细胞,符合WHO规定的关于用于基因工程产品的外源基因转化细胞的标准。

EPO工程细胞株支原体检测

支原体污染是细胞培养过程中最常见的问题之一,对细胞支原体的检测是细胞特性鉴定的重要方面。我们采用抗支原体单抗免疫荧光法和培养法(包括液体培养法和固体培养法)检测工程细胞支原体。单抗免疫荧光法检测结果表明:支原体阳性的细胞膜表面有明亮荧光,工程细胞EPO C_2细胞膜表面无荧光。支原体液体培养法结果显示:作为阳性对照的支原体由于在生长过程中产酸使培养液变黄,而加入EPOC_2株细胞悬液的样品管与阴性对照管相同,无颜色变化。固体培养法结果显示:在显微镜下观察,支原体阳性对照在固体培养基上呈荷包蛋样集落,而阴性对照及EPO C_2株细胞样品均无菌落生长。以上结果表明:受检的EPO C_2株细胞未被支原体污染。

葡萄糖和丁酸钠对CHO-rHSA工程细胞株中rHSA产量的影响

目前,悬浮CHO细胞作为外源蛋白的最有潜力的工程细胞株被广泛应用,探索其高密度生长和高表达外源蛋白的培养条件也成为研究的热点。葡萄糖和丁酸钠在促进CHO细胞生长和外源蛋白表达方面具有重要作用,所以研究葡萄糖和丁酸钠对CHO-rHSA工程细胞表达重组人血清白蛋白的影响有重要的应用价值。首先利用单因素试验确定了葡萄糖和丁酸钠对CHO-rHSA工程细胞表达重组人血清白蛋白的作用,并筛选出最优添加条件;然后利用双因素组合作用试验优选出可有效提高rHSA表达量的葡萄糖及丁酸钠的组合培养条件。细胞培养第3天开始,每48 h添加终浓度为7 g/L的葡萄糖,可使rHSA产量平均提高121.93%;细胞培养第2天添加终浓度为1.0 mmoL/L的丁酸钠,可使rHSA产量平均提高110.01%;丁酸钠和葡萄糖组合使用可使CHO-rHSA工程细胞株培养时间从7 d左右延长到14 d左右,使rHSA表达量达平均达到了85.642 mg/L,rHSA表达量与未处理组相比平均提高了212.49%,比单独使用葡萄糖平均提高了134.85%,比单独使用丁酸钠平均提高了88.35%。确定待细胞培养48 h 时添加1.0 mmol/L 丁酸钠和3.0→7.0 g/L葡萄糖为CHO工程细胞株高效表达的培养条件。丁酸钠和葡萄糖组合使用可更高效的表达外源蛋白,葡萄糖可以减弱丁酸钠对CHO细胞生长的抑制作用,为提高CHO工程细胞株外源蛋白表达提供新的理论依据。

基因编辑技术在CHO工程细胞株改造中的应用研究进展

基因编辑技术是近几年迅速发展起来、可实现对基因组进行靶向精确修饰的一种生物技术,通过该技术可对基因进行定位突变、插入或敲除。从最初应用的锌指核酸酶（zinc-finger nucleases,ZFNs）到转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effectors nucleases,TALENs）,再到近两年愈加火热的CRISPR/Cas9系统,随着新基因编辑工具的不断发掘,对基因组进行定向改造的工作将变得更加高效精准、方便快捷。

单克隆接种/成像设备VIPS在CHO工程细胞株单克隆筛选中的应用

目的探讨应用单克隆接种/成像设备VIPS(Verified In-situ Plate Seeding)建立CHO工程细胞株单克隆筛选的方法。方法采用VIPS将稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 1分别于含不同组合(共18种组合,编号1~18)及体积(100和200μL/孔)培养基的96孔板中进行单细胞接种,并进行单克隆源性追踪拍照,根据图像结果,计算单克隆接种率、克隆形成率、单克隆增殖速率,评价单克隆源性图像效果。通过稳定转染目的基因的细胞池Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4验证该方法的适用性。结果最适单克隆培养基为MediumⅡ,培养基体积为100μL/孔。最佳工艺条件下,Cell pool 1的单克隆接种率为80%,克隆形成率为83%,增殖速率较快,单克隆源性图像清晰。Cell pool 2、Cell pool 3、Cell pool 4在最佳工艺条件下,单克隆接种率均值为78%,克隆形成率均值为67%,增殖速率略有差异,细胞分裂过程图像均清晰。结论采用VIPS建立的CHO工程细胞株单克隆筛选方法可提高CHO工程细胞株的克隆形成率,且能够提供充分的单克隆源性证明。

人尿激酶原工程细胞株 C L-11 G 细胞外源因子的检测

目的：对工程细胞株的要求之一是不应被外源因子污染。因此有必要对表达人尿激酶原的工程细胞株 Ｃ Ｌ１１ Ｇ 进行外源因子的检测。方法：用普通肉汤、改良马丁和硫乙醇酸盐三种培养基对 Ｃ Ｌ１１ Ｇ 细胞进行培养，检查细菌和霉菌；用培养法、 Ｄ Ｎ Ａ 荧光染色法、单克隆抗体免疫荧光法及电镜检查支原体；用 Ｃ Ｌ１１ Ｇ 细胞悬液分别接种乳小鼠、成年小鼠、豚鼠、家兔、鸡胚及 ５ 种细胞，检查有无内外源性病毒污染。结果： Ｃ Ｌ１１ Ｇ 细胞经上述几种方法检测均未发现有细菌、霉菌及支原体污染。接种的动物全部存活，无异常，５ 种细胞接种 Ｃ Ｌ１１ Ｇ 细胞后细胞形态正常，无病变，红细胞吸附试验均为阴性。结论：人尿激酶原工程细胞株 Ｃ Ｌ１１ Ｇ 细胞经多方检查，未发现细菌、霉菌、支原体及内外源性病毒污染，从细胞水平上讲是安全的，可以作为生产重组人尿激酶原溶栓药物的工程细胞株。

不同降温温度对抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长及蛋白表达的影响

目的摸索适合抗破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株生长和抗体蛋白表达的降温温度,为细胞培养工艺的建立提供参考。方法在体积为125 mL的培养瓶中,按50万个/mL的初始密度接种CHO工程细胞种子,采用补料分批培养模式,在转速125 r/min,CO_(2)浓度5.0%,湿度80%的温控培养摇床中进行细胞培养。对照组培养温度设定为37℃恒温;试验组初始培养温度设定为37℃,待培养瓶中的细胞密度达到1000万个/mL时,将培养瓶分别转到35℃、34℃和33℃的摇床继续培养。每日取样,分别检测培养液的活细胞密度、细胞活率、葡萄糖、乳酸、NH^(+)_(4)、渗透压和抗体蛋白滴度。当细胞活率<80%时,停止培养。与对照组比较,选择细胞生长较好,代谢副产物浓度较低且抗体蛋白滴度最高的温度为最终降温温度。结果对照组的最高活细胞密度为2000万个/mL,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃培养条件下的最高活细胞密度分别为2210万、1940万和1890万个/mL;与对照组相比,试验组培养后期的细胞活率维持较高水平;葡萄糖、乳酸和NH^(+)_(4)代谢趋势一致,且试验组代谢副产物乳酸和NH^(+)_(4)浓度低于对照组;各培养组渗透压变化趋势一致,都在可接受范围内;最终抗体蛋白滴度对照组为1196 mg/L,试验组37℃转到35℃、37℃转到34℃和37℃转到33℃的分别为1772、1962和1929 mg/L。结论选取34℃为破伤风毒素抗体重组CHO工程细胞株的降温培养温度,进行后续培养工艺的建立。

人红细胞生成素(EPO)工程细胞建立及特性分析

构建了EPO真核表达质粒 ,成功地实现了其在CHO dhfr- 细胞中的表达 ,所得到的EPO工程细胞株的形态与CHO dhfr- 细胞相似 ,细胞株小瓶静止培养时最高表达水平为 2～ 3μg/10 6 cells/2 4h ,而且细胞表达稳定 ,连续传代三个月和反复冻存复苏三次 ,细胞表达水平无明显下降。经过对细胞的一系列特性分析表明 ,该细胞株无支原体、真菌及细菌污染 ,无致瘤性 ,形态正常 ,染色体畸变率与出发株相当。

肝癌多药耐药基因工程细胞的建立及特性分析

目的利用转基因方法建立表达mdr1基因的肝癌基因工程细胞,为深入肝癌多药耐药现象研究提供理想的细胞模型。方法构建表达mdr1cDNA全长序列的真核表达载体PCI/mdr1,利用脂质体将mdr1cDNA转染入人肝癌细胞株HepG2细胞,通过阿霉素短暂诱导和G418筛选转染阳性细胞,筛选出稳定表达mdr1及P-gp蛋白的细胞株HepG2/R。结果HepG2/R细胞与出发株HepG2细胞相比较,MTT法检测生长曲线并无明显差异,对阿霉素和丝裂霉素的耐药性分别增加了35.7倍和125倍,RT-PCR检测HepG2/R细胞的mdr1mRNA表达明显增加,流式细胞仪检测HepG2/R细胞P-gp的表达状况明显增加。结论成功建立表达mdr1基因的肝癌工程细胞株。

HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的:构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体,并运用Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达该细胞的CHO工程细胞株。方法:应用PCR技术以pcMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆入pcDNA5/FRT载体中;通过Flp-InTM定点整合表达系统将e23sFv-Fdt-tBid整合入Flp-lnTM CHO细胞的基因组中一个单拷贝位点上,以适当的潮霉素B筛选定点整合e23sFv-Fdt-tBid cDNA的细胞克隆;通过基因组PCR技术和Westernblot技术检测e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达。结果:成功构建了pcDNA5/FRT-e23sFv-Fdt-tBid表达载体;成功通过Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达e23sFv-Fdt-tBid蛋白的CHO工程细胞株;成功通过基因组PCR技术及基因组PCR技术和Western blot技术检测了e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达。结论:成功地构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体并建立了稳定表达该蛋白的CHO工程细胞株,为该蛋白的应用研究奠定了重要基础。