工程酿酒酵母产番茄红素的提取纯化工艺优化及结构鉴定

为探究工程酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)发酵生产的番茄红素提取纯化方法及其结构,通过单因素和正交试验优化番茄红素的提取纯化工艺,并采用核磁共振(NMR)技术对其结构进行鉴定。结果表明,番茄红素的最佳提取工艺条件为酸热破壁:盐酸浓度3.0 mol/L,盐酸用量3.0 mL/0.1 g菌体,酸化时间60 min,酸化温度45℃;NaOH脱脂:NaOH浓度0.10 mol/L、NaOH用量2.0 mL/0.1 g菌体、皂化时间30 min,皂化后水浴温度40℃;丙酮提取∶料液比1∶20(g∶mL),提取温度40℃,提取时间50 min。最佳纯化工艺为正己烷析晶:40℃下用正己烷将粗提物溶解过滤,-20℃析晶12 h。在此优化提取纯化工艺条件下,番茄红素提取率为76%,纯度为96.7%。NMR结果显示,番茄红素结构为全反式番茄红素,与植物源番茄红素结构一致。

α-淀粉酶和糖化酶的表达及酿酒酵母工程菌的构建

将切除了５′端非编码区５０碱基对片段的黑曲霉糖化酶ＧＡＩｃＤＮＡ与大麦α淀粉酶基因重组进大肠杆菌酵母穿梭载体，构建重组表达质粒ｐＭＡＧ１１，转化酿酒酵母ＧＲＦ１８，获得含α淀粉酶和糖化酶双基因的酵母工程菌ＧＲＦ１８（ｐＭＡＧ１１）．在酵母ＰＧＫ基因启动子和终止信号的调控下，α淀粉酶和糖化酶基因获得高效表达，９９％的表达产物分泌至胞外．在含ｗ＝１５％的可溶性淀粉的ＹＰＳ培养基中培养４４ｈ，淀粉水解率达到９９％。

酿酒酵母工程菌产3-甲硫基丙醇的发酵条件优化

为提高天然香料3-甲硫基丙醇的得率,本研究采用单因素和正交设计实验对表达脱羧酶酿酒酵母工程菌的发酵条件进行优化。确定了工程菌的最佳发酵培养基为:蛋氨酸5g/L,微量元素2%(v/v),酵母提取物4g/L,蛋白胨12g/L,KH2PO410g/L,K2HPO42g/L,葡萄糖20g/L,G418 400μg/L。最适发酵条件为:接种量10%,pH为5,发酵温度30℃,转速200r/min。优化后3-甲硫基丙醇的浓度可达4.38g/L,较初始条件提高了3.5倍。

酿酒酵母代谢木糖工程菌的构建

通过PCR方法从休哈塔假丝酵母基因组DNA中克隆得到木糖还原酶(XR)基因XYL1和木糖醇脱氢酶(XDH)基因XYL2,将其分别连接到酵母表达载体pYES2上,得到重组表达载体pYES2-XYL1和pYES2-XYL2,从pYES2-XYL1上克隆得到含半乳糖启动子的XYL1,将其连接到pYES2-XYL2序列的下游,得到重组表达载体pYES2-XYL1-XYL2,通过电转化方法将pYES2-XYL1-XYL2转入酿酒酵母宿主菌INVSc1。在初始pH为5.5,温度为33℃,前5h转速为150r/min,后变为50r/min的条件下,乙醇产量为33.45g/L。

ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响

为了研究ST酿酒酵母基因工程菌对大鼠肠道菌群的影响,试验将90只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、工程菌组及酵母菌组,分别灌服生理盐水、工程菌菌液、酿酒酵母菌菌液,持续21 d后连续3 d灌服大肠杆菌H10407菌液,分别收集灌胃7,14,21天及攻毒后的各组大鼠粪便,提取粪便细菌DNA,利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)、实时荧光定量PCR检测了ST酿酒酵母基因工程菌对肠道菌群微生物可操作单元(OTU)和肠道5种重要细菌(类杆菌、梭菌、肠球菌、双歧杆菌和乳杆菌)数量的变化,并测定了肠道菌群pH值。结果表明:在灌胃期间,工程菌组及酵母菌组的OTU值和双歧杆菌、梭菌数量极显著高于空白对照组(P<0.01),其他细菌数量均不同程度升高。各组pH值均呈现下降趋势,第21天时,工程菌组及酵母菌组pH值极显著低于空白对照组(P<0.01)。攻毒产肠毒素大肠杆菌后,工程菌OTU值和类杆菌、乳杆菌、双歧杆菌数量均极显著高于其他两组(P<0.01),pH值极显著高于空白对照组(P<0.01)。与灌服前相比,工程菌组的OTU值、细菌数量及pH值均变化幅度最小。说明ST酿酒酵母基因工程菌能够改善肠道菌群结构,丰富肠道菌群多态性,降低pH值,增加有益菌群的数量。当动物机体受到产肠毒素大肠杆菌感染时,ST酿酒酵母基因工程菌能够有效降低产肠毒素大肠杆菌对肠道菌群的破坏,发挥预防保护作用,维持肠道内菌群稳定。

一步法产1,3-丙二醇酿酒酵母基因工程菌的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,发酵法生产1,3-PD是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。本研究在前期工作的基础上,将分别来源于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串联表达,构建重组表达载体pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB;并得到重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。该重组菌和对照S.cerevisiae分别以葡萄糖为底物摇瓶发酵72h后,重组酿酒酵母发酵液中1,3-PD含量约为1.5g/L;而对照菌株不产1,3-PD。以上结果表明本研究在国内首次成功构建了直接以葡萄糖为底物发酵生产1,3-PD的酿酒酵母基因工程菌。为进一步将dhaB、yqhD基因导入其他以葡萄糖为底物高产甘油的酵母宿主中表达,获得以葡萄糖为底物一步法发酵高产1,3-丙二醇工程菌打下了坚实的基础。

可降解淀粉酿酒酵母基因工程菌的构建及其生产应用

将酿酒酵母的rDNA片段,黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因表达盒及G418抗性基因表达盒重组进经过改造的质粒pSP72,构建酿酒酵母整合型质粒YIp4RGAn及YIp19RGAn,转化酿酒酵母实验室菌株GRF18、生产菌株JL108、SD和JM,获得能高效表达葡萄糖淀粉酶和分解淀粉的酿酒酵母基因工菌。Southern印迹分析证明,葡萄糖淀粉酶基因已整合进工程菌染色体。这些工程菌在含有20%淀粉的培养基中培养,产酒率都在11%以上。

酿酒酵母工程菌发酵产青蒿酸的工艺优化

通过酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae 1211)发酵制备青蒿酸,并通过单因素实验和响应面优化,考察了发酵温度、pH、半乳糖质量浓度、发酵碳源及发酵氮源等对青蒿酸发酵产量的影响。结果表明:在发酵温度30℃,发酵培养基初始pH=5.5,发酵培养基中蔗糖质量浓度91.8 g/L,半乳糖质量浓度10.1 g/L,硫酸铵质量浓度10.3 g/L,磷酸二氢钾质量浓度8.7 g/L的条件下,青蒿酸发酵产量可达(1529.7±12.6)mg/L,与未优化时的发酵产量相比,提升了67.1%。

ChIFN-γ酿酒酵母工程菌粉的毒性与营养分析

从感官特性、微生物和重金属含量及营养成分等方面,对具有抗禽病毒活性的Ch IFN-γ酿酒酵母工程菌粉进行毒性和营养品质分析。结果表明,Ch IFN-γ酿酒酵母工程菌粉具有酵母的正常特性,含水量低,复水后活细胞率高;其细菌、霉菌、铅和总砷含量均符合国标卫生学要求。工程菌粉的灰分、总糖、总磷和总钙含量高于野生型菌粉,粗脂肪含量与野生型菌粉接近,但粗蛋白质和粗纤维含量显著低于野生型菌粉;工程菌粉的总必需氨基酸和总非必需氨基酸含量较高,赖氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸3种必需氨基酸的含量高于野生型菌粉;第一限制性氨基酸为苯丙氨酸+酪氨酸,第二限制性氨基酸为缬氨酸。工程菌粉的蛋白模式不符合蛋白质饲料要求。

酿酒酵母工程菌产青蒿酸的发酵动力学研究

以青蒿酸产量为考察指标,在50 L发酵罐中对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌1211发酵产青蒿酸的溶氧参数进行优化。在此基础上,根据Logistic方程及Luedeking-Piret方程构建酿酒酵母工程菌1211分批发酵产青蒿酸的动力学模型。结果表明,当溶氧参数为25%~30%时,青蒿酸产量最高,为(6 269.6±100.3)mg/L。青蒿酸合成与菌体生长呈现部分生长偶联型。通过Origin 9.0软件对动力学模型进行非线性拟合,发现S. cerevisiae工程菌1211的菌体繁殖生长、青蒿酸合成以及基质消耗动力学模型的拟合度R2分别达到了0.995 85、0.979 04和0.995 48,该动力学模型能够很好的描述S. cerevisiae工程菌1211分批发酵过程。该研究为青蒿酸的低成本发酵及工业化大规模发酵生产提供了理论基础。

黑曲霉糖化酶和木聚糖酶基因在工业用酿酒酵母中的共表达

构建了黑曲霉糖化酶、木聚糖酶基因双表达的酵母YIp型载体pNEW4,通过与G418抗性质粒共转化,将糖化酶和木聚糖酶基因表达元件整合到多倍体酒精生产用酵母S. cerevisiae2.346染色体上,获得了整合型分泌表达这两种酶的工业酿酒酵母工程菌株GX11,研究了重组糖化酶和木聚糖酶在酵母工程菌中的表达及性质。

URA3基因影响青蒿酸酿酒酵母工程菌中试发酵产量

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于工程酿酒酵母的基因插入、基因替换和基因敲除,通过使用选择标记进行基因编辑具有简单高效的特点。前期利用CRISPR/Cas9系统敲除青蒿酸生产菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)1211半乳糖代谢负调控基因GAL80,获得菌株S.cerevisiae 1211-2,在不添加半乳糖诱导的情况下,青蒿酸摇瓶发酵产量达到了740 mg/L。但在50 L中试发酵实验中,S.cerevisiae 1211-2很难利用对青蒿酸积累起到决定性作用的碳源-乙醇,青蒿酸的产量仅为亲本菌株S.cerevisiae 1211的20%–25%。我们推测因遗传操作所需的筛选标记URA3突变,影响了其生长及青蒿酸产量。随后我们使用重组质粒pML104-KanMx4-u连同90 bp供体DNA成功恢复了URA3基因,获得了工程菌株S.cerevisiae 1211-3。S.cerevisiae 1211-3能够在葡萄糖和乙醇分批补料的发酵罐中正常生长,其青蒿酸产量超过20 g/L,与亲本菌株产量相当。研究不但获得了不加半乳糖诱导的青蒿酸生产菌株,同时首次发现了营养缺陷型标记URA3基因显著影响乙醇补料的中试发酵中青蒿酸的产生,也为酵母作为底盘来进行其他天然产物的生产提供了借鉴。

酿酒酵母及EtpA酿酒酵母基因工程菌对大鼠小肠黏膜结构的影响

为了调查酿酒酵母及Etp A酿酒酵母基因工程菌对大鼠小肠黏膜生长发育状况的影响,120只健康断奶SD大鼠,随机分为空白对照组、酿酒酵母菌组、Etp A酿酒酵母基因工程菌组,分别灌胃生理盐水、酿酒酵母菌液、Etp A酿酒酵母基因工程菌液2 m L/只,持续28 d后连续3 d灌胃大肠杆菌菌液。分别取7、14、21和28 d及灌胃大肠杆菌后大鼠的十二指肠、空肠、回肠制作石蜡切片,HE染色,显微镜下观察,记录各段小肠绒毛的宽度、长度、隐窝深度及绒毛长度/隐窝深度比值(V/C)。结果显示:1)与空白对照组相比,酿酒酵母菌组及Etp A酿酒酵母基因工程菌组的十二指肠绒毛长度、V/C在第21和28天时均显著升高(P<0.05);空肠绒毛长度、V/C在第28天均极显著升高(P<0.01)同时隐窝深度显著下降(P<0.05);回肠V/C在第28天显著升高(P<0.05);各肠段绒毛宽度均无显著差异(P>0.05)。2)灌胃大肠杆菌后,与Etp A酿酒酵母基因工程菌组相比,空白对照组及酿酒酵母菌组的空肠绒毛长度、V/C均极显著下降(P<0.01);回肠V/C均显著下降(P<0.05)。结果表明:酿酒酵母和Etp A酿酒酵母基因工程菌均可以促进肠道黏膜发育,提高消化吸收能力;Etp A酿酒酵母基因工程菌对肠道黏膜的保护作用更显著。

产青蒿酸酿酒酵母工程菌的抗性筛选

本研究以产青蒿酸的酿酒酵母工程菌为出发菌株,通过3 种抗菌素(诺尔斯菌素、遗传霉素和潮霉素B)对出发菌株进行抗性筛选。研究表明,当诺尔斯菌素和潮霉素B 复合添加且添加浓度分别为150 和100 μg/ml 时,经抗性筛选获得的抗性菌株发酵产量高达(926.8±21.9)mg/L,与出发菌株的(785.3±18.1)mg/L 相比提高了18.0%。经多次传代验证,经抗性筛选获得的菌株遗传稳定性好,具备工业化生产价值。

我国秸秆生物转化燃料酒精研究现状

重点介绍了我国自主技术开发的秸杆预处理、产酶菌的诱变育种、纤维素酶活性提高技术、酶系组分的现代生物技术应用、酿酒酵母工程菌的构建和发酵工艺、酒精脱水等新技术应用,展望了秸杆生物转化酒精的可能的工业化途径。

Recent advances in metabolic engineering of microorganisms for production of tyrosol and its derivatives

Tyrosol is a natural phenolic compound with antioxidant,anti-inflammatory and other biological activities,serving as an important precursor of high-value products such as hydroxytyrosol and salidroside.Therefore,the green and efficient biosynthesis of tyrosol and its derivatives has become a research hotspot in recent years.Building cell factories by metabolic engineering of microorganisms is a potential industrial production way,which has low costs and environmental friendliness.This paper introduces the biosynthesis pathway of tyrosol and presents the key regulated nodes in the de novo synthesis of tyrosol in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.In addition,this paper reviews the recent advances in metabolic engineering for the production of hydroxytyrosol and salidroside.This review can provide a reference for engineering the strains for the high-yield production of tyrosol and its derivatives.

秸杆生物转化燃料酒精研究现状

重点介绍了我国自主技术开发的秸杆预处理、产酶菌的诱变育种、纤维素酶活性提高、酶系组分的现代生物技术应用、酿酒酵母工程菌的构建和发酵工艺、酒精脱水等新技术应用,展望了秸杆生物转化酒精的可能的工业化途径。