生物制剂工艺特异性残留宿主蛋白ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立基因重组生物制剂中工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA检测方法,并进行验证。方法 以大肠埃希菌表达胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide,GLP)的生产与纯化工艺为特定工艺模型,采用同一工艺用于空载大肠埃希菌(不表达重组蛋白的正常大肠埃希菌)残留蛋白的截取。将获得的残留蛋白作为免疫原分别免疫1只雌性新西兰白兔和6只雌性昆明小鼠,以兔免疫血清纯化IgG抗体为包被抗体,鼠免疫血清为第二夹心抗体,抗鼠IgG-HRP为酶标二抗,建立工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA方法。对建立的方法进行特异性、准确性、精密性验证,并确定方法的检测限。同时采用建立的方法和市售大肠埃希菌宿主蛋白残留检测试剂盒对纯化的GLP制剂进行残留蛋白定量测定。结果 对已知浓度的工艺特异性残留蛋白进行系列梯度稀释后,建立的ELISA方法检测的灵敏度可达338 pg/mL;该方法检测CHO和酵母细胞裂解蛋白无交叉反应,检测低、中、高3个浓度样品的回收率均在80%~120%范围内,检测低、中、高浓度空载大肠埃希菌截留液标准品的试验内和试验间CV均<15%。针对GLP制剂中的残留蛋白,与建立的方法检出的GLP制剂中残留蛋白总量相比,约有62%的残留蛋白未被市售非工艺特异性ELISA试剂盒检出,这些残留蛋白应为本工艺特异的残留蛋白。结论 建立的双抗体夹心ELISA法检测工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白灵敏度高,特异性强,准确性和精密性良好,可满足残留蛋白在生物制剂中低于0.01%~0.1%标准的检测要求。

流感疫苗工艺特异性MDCK宿主蛋白ELISA检测方法的建立与应用

目的建立一种能够检测MDCK细胞基质流感疫苗中宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)含量的双抗体夹心ELISA并进行验证。方法通过培养MDCK细胞获取工艺特异性的MDCK HCP,进一步处理获得参考品。将MDCK HCP分别免疫新西兰兔和波尔山羊获得抗HCP的多克隆抗体。抗体经纯化后进行SDS-PAGE分析,间接ELISA分析鉴定抗体效价并验证特异性,选择效价较高的兔抗体作为包被抗体,使用HRP标记羊抗体获得显示抗体,从而建立检测MDCK HCP的双抗体夹心ELISA。确定该方法所用抗体的工作浓度以及线性范围,验证准确性、重复性、中间精密度、耐用性和特异性。然后,使用该方法对生产过程中的样品进行检定,并将检测结果与商品试剂盒的检测结果进行比对。结果制备的HCP参考品相对分子质量分布在25000~80000之间,抗原质量浓度为31.74μg/mL。免疫新西兰兔和波尔山羊获得高质量抗体,抗体效价分别为1∶512000、1∶128000,纯化后的多抗特异性良好。选择抗体效价较高的兔抗体作为包被抗体,工作浓度较高的酶标羊抗作为显示抗体建立双抗体夹心ELISA。方阵滴定法确定了包被抗体工作质量浓度为4μg/mL,显示抗体的工作浓度为1∶3200,该方法在20~400 ng/mL范围内线性关系良好(R^(2)>0.99),不同浓度的MDCK HCP回收率在95.62%~113.82%之间,CV<10%,重复性和中间精密度结果的CV<10%,显示抗体孵育时间在0.5~1.5 h内对实验无影响,显色时间在10~20 min内对实验无影响,特异性良好。使用该方法对生产样品进行检测,与商用试剂盒的检测结果差异无统计学意义(P=0.236,P>0.05)。结论建立了能检测MDCK细胞基质流感疫苗中残留HCP的双抗体夹心ELISA,方法学验证结果良好,可用于MDCK细胞基质流感疫苗生产中残留HCP的检定,对疫苗生产质量控制具有重要意义。