左旋多巴酪氨酰酪氨酸二肽的合成及与DNA的相互作用

采用Fmoc固相法合成了左旋多巴酪氨酰酪氨酸二肽(L-dopa-L-Tyr-L-Tyr),并经RP-HPLC分离和纯化,通过ESI-MS,1H NMR和13C NMR表征了其结构.采用紫外光谱、荧光光谱和琼脂糖凝胶电泳研究了左旋多巴(L-dopa)及L-dopa-L-Tyr-L-Tyr与DNA的相互作用.结果表明,随着L-dopa和L-dopa-L-Tyr-L-Tyr浓度的增加,体系的紫外光谱呈减色效应;根据Stern-Volmer方程可知荧光猝灭方式为静态猝灭;琼脂糖凝胶电泳中,pUC18DNA的迁移速率变慢.推测L-dopa和L-dopa-L-Tyr-L-Tyr与ctDNA作用模式为嵌入作用.与L-dopa相比,L-dopa-L-Tyr-L-Tyr与DNA的相互作用更强.

高效液相色谱法对N-乙酰-L-酪氨酸生产工艺的中间物监控分析

为了探讨在生产N-乙酰-L-酪氨酸时,中间物料对产品质量的影响,试验研究了在采用乙酸酐乙酰化生产N-乙酰-L-酪氨酸过程中,对中间产生物料L-酪氨酸、N-乙酰-L-酪氨酸和N,O-二乙酰-L-酪氨酸的中控分析并测定它们的含量。具体方法是:把样品用超纯水稀释100倍后,在色谱柱(C_(18),150mm×4.6mm,5μm)上进行分离,以10mmol·L^(-1)磷酸盐(pH3.0)-甲醇(60:40,V/V)为流动相进行等度洗脱,在波长270nm处进行紫外检测。结果表明:L-酪氨酸、N-乙酰-L-酪氨酸、N,0-二乙酰-L-酪氨酸的质量浓度分别在10~1000mg·L^(-1),10~1000mg·L^(-1),50~1000mg·L^(-1)内与对应的峰面积呈现线性关系,检出限(3S/N)分别为1.1mg L^(-1),1.2mg·L^(-1),14.0mg·L^(-1);对实际样品进行加标回收试验,回收率分别在98.4%~105.0%,98.5%~100.8%,98.9%~100.5%之间,测定值的相对标准偏差RSD(n=6)分别为1.8%、0.7%和0.9%,均小于2.0%。说明所建立的高效液相方法切实可行,重现好,精密度高,可用于乙酰酪氨酸生产工艺中间物的监控分析。

纳米复合载体固定酪氨酸酶合成左旋多巴

利用模板法制备大孔SiO_(2)材料,而后借助水热合成法在孔道中生长ZnO纳米线,得到新型纳米复合材料(SiO_(2)/ZnO NWs).采用静电吸附法将酪氨酸酶(TYR)固定在纳米复合载体上,用于L-多巴合成.从扫描电子显微镜中观察到ZnO纳米线在孔道中呈现无规线团形貌,且分布均匀.TYR在SiO_(2)/ZnO NWs上的最大负载量高达162.3mg·g-1,约是纯大孔SiO_(2)载体3倍,且远高于其他固定化TYR系统.利用固定化TYR进行L-多巴合成,在最优反应条件(35℃、pH6.0、L-抗坏血酸浓度10 mmol·L-1)下催化1.5h,L-多巴的产率可达70.2%.固定化TYR展现良好的储存稳定性,储存28d仍保持78.6%的相对活性,远高于游离状态TYR,并可重复使用,经历10个循环后仍能保持42.1%的L-多巴产率.

L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品研制

根据GB/T 15000标准样品工作导则,研制L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品。经制备液相方法纯化得到的L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品,通过UV、IR、MS和NMR等方法进行结构鉴定,并进行均匀性、稳定性检验,最后采用质量平衡法和核磁共振法进行定值。L-丙氨酰-L-酪氨酸标准样品均匀性和稳定性良好,其定值结果为99.21%,置信度95%的扩展不确定度为0.46%。所制备的L-丙氨酰-L-酪氨酸样品满足标准样品工作导则的要求,可以用于L-丙氨酰-L-酪氨酸相关产品的方法验证和质量控制。

虫酰肼对甜菜夜蛾多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的抑制作用

虫酰肼模拟昆虫蜕皮激素的作用干扰新表皮的形成。为了探讨虫酰肼对昆虫新表皮形成的影响是否与抑制表皮形成相关酶的活性有关,本研究应用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-RP),测定了甜菜夜蛾Spodopteraexigua5龄幼虫用虫酰肼处理不同时间(24,48和72h)后多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的活性。结果表明:用LC11(28.41μmol/L)和LC33(85.23μmol/L)两个亚致死剂量的虫酰肼处理5龄幼虫后,多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的活性均受到明显抑制,高浓度的抑制作用大于低浓度的抑制作用。随着处理时间的延长,同一剂量的抑制作用逐渐增强。进一步测定虫酰肼处理24,48和72h后5龄幼虫血淋巴、脂肪体、中肠、表皮和头部的多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的活性,可看出虫酰肼对幼虫不同组织的多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的活性也具有相似的抑制作用。结果提示,虫酰肼对甜菜夜蛾幼虫多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶活性具有明显抑制作用,幼虫新表皮形成受阻可能与虫酰肼抑制多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的活性有关。

参附注射液联合左旋多巴对帕金森病小鼠黑质组织形态及酪氨酸羟化酶水平的影响

目的研究参附注射液联合左旋多巴对帕金森病小鼠黑质组织形态及酪氨酸羟化酶水平的影响。方法 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射制备帕金森病小鼠模型,分别给予左旋多巴、参附注射液、参附注射液+左旋多巴14 d后,检测小鼠神经行为学,ELISA法检测血液及脑组织中酪氨酸羟化酶(TH)水平,HE染色观察脑组织黑质区神经元,免疫组化染色、Western blot法检测脑组织黑质区TH蛋白表达。结果参附注射液可显著缩短爬杆时间,增加悬挂能力评分,提高TH水平及蛋白表达(P<0.05,P<0.01),联合左旋多巴应用时上述指标改善更明显(P<0.05,P<0.01)。结论参附注射液对帕金森病小鼠有神经保护作用,联合左旋多巴时效果更强。

复方地黄方对帕金森病左旋多巴毒副反应大鼠酪氨酸羟化酶变化的影响

目的探讨复方地黄方对帕金森病(PD)左旋多巴(LD)毒副反应大鼠酪氨酸羟化酶(TH)变化的影响。方法采用经典的6-羟基多巴胺(6-OHDA)脑立体定向注射术建立PD大鼠模型,进一步腹腔注射2 w左旋多巴制备毒副反应模型(LD模型)。将成功的LD模型分为LD模型组和复方地黄方组,同时纳入正常对照组和假手术组,每组18只,两组在继续给予LD的同时,复方地黄方组给予中药复方地黄方治疗2、4、6 w,并运用免疫组化法观察各个时间点黑质TH的表达。结果从同一时间点来看,LD模型组和复方地黄方组TH表达均低于各个时间点的正常对照组和假手术组(P<0.001),复方地黄方组TH表达均高于各个时间点的LD模型组,其中治疗4、6 w差异显著(P<0.001);从不同时间点来看,随着治疗时间的延长,LD模型组TH表达呈不断减少趋势,治疗6 w与治疗2 w比较差异显著(P<0.01),复方地黄方组TH表达呈不断增加趋势,治疗6 w与治疗4、2 w比较差异均显著(P<0.001)。结论复方地黄方能明显增加TH的表达,减少DA神经元的死亡,从而减轻LD的毒副反应。

色氨酰酪氨酸缩聚二肽体系的电子转移研究

在过渡态理论框架下,用经典轨迹方法、两态模型近似,采用AM1半经验方法及从头算方法探讨了色氨酰酪氨酸缩聚二肽体系的电子转移过程.对于包含桥体的二肽体系的分子内电子转移过程,采用UHF/6-31G水平上电子给体、受体优化结果,和分子轨道电荷定域初始猜测诱导SCF技巧,在UHF/6-31G水平上用线性反应坐标构造出给体、受体分子间电子转移的双势阱,得到两透热势能面交叉处的反应坐标R约为-0.217,表明气相反应发生在反转区.生物体系电子转移反应的研究对探讨某些生命或生理机制具有十分重要的意义.

雀嘴茶中三大酚类成分的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性分析

为深入挖掘雀嘴茶的利用价值,本文以其中含量丰富的6’-O-咖啡酰熊果苷(CA)、β-熊果苷和绿原酸三大酚类成分为研究对象,对其抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性进行分析。结果表明,雀嘴茶三大酚类成分均表现出较好的抗氧化活性,6’-O-咖啡酰熊果苷(CA)、β-熊果苷和绿原酸清除DPPH自由基的IC_(50)值分别为13.56±0.14、104.41±6.52和8.42±0.21μg/mL,清除ABTS+自由基的IC_(50)值分别为18.01±0.06、50.60±1.25和26.93±0.38μg/mL,清除OH自由基的IC_(50)值为2.64±0.06、>10.00和<1.00 mg/mL,对铁离子总还原能力的强度依次为绿原酸>CA>β-熊果苷;雀嘴茶三大酚类成分对酪氨酸酶的抑制活性差异较大,CA对酪氨酸酶兼具单酚酶和二酚酶抑制作用,其IC_(50)值分别为1.114±0.035和95.198±1.117μmol/L,β-熊果苷仅有单酚酶抑制作用,IC_(50)值为681.335±17.975μmol/L,绿原酸既无单酚酶抑制作用,也无二酚酶抑制作用。研究结果为雀嘴茶中活性成分的开发利用提供了重要参考。

左旋多巴对帕金森病模型大鼠结肠酪氨酸羟化酶和α-突触核蛋白表达的影响

目的探讨左旋多巴(L-dopa)对帕金森病(PD)模型大鼠结肠酪氨酸羟化酶(TH)及α-突触核蛋白(α-Syn)表达的影响。方法健康SD大鼠72只随机分为对照组、帕金森病模型组(模型组)、左旋多巴治疗组(治疗组),各组随机再分为模型制备成功后4 d、8 d 2个亚组,各12只。采用大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病模型,免疫组化法和Western blotting蛋白印迹法检测结肠TH和α-Syn表达水平。结果 1 h粪便排出量及含水量:与对照组比较,模型组、治疗组大鼠显著降低(P<0.05);与模型组比较,治疗组大鼠增加(P<0.05);与治疗4 d亚组比较,治疗8 d亚组增加(P<0.05)。免疫组化法与Western blottng检测TH、α-Syn比较:(1)与对照组比较,模型组、治疗组各时间点结肠TH阳性细胞及蛋白表达均明显减少,α—Syn阳性细胞及蛋白表达均明显增加(P均<0.05);(2)与模型组比较,治疗组各时间点结肠TH阳性细胞及蛋白表达均增多,α—Syn阳性细胞及蛋白表达均明显减少(P均<0.05);(3)与治疗4 d亚组比较,治疗组治疗8 d亚组的TH阳性细胞及蛋白表达升高(P<0.05),α—Syn阳性细胞及蛋白降低(P<0.05)。结论 PD模型大鼠结肠功能障碍的机制可能与多巴胺的减少及α—Syn水平的增多有关,左旋多巴可能通过增加多巴胺和减少α—Syn水平改善PD大鼠结肠功能障碍。

重组酪氨酸酚裂解酶催化制备左旋多巴

采用生物酶催化法替代化学合成法制备左旋多巴是一条绿色、经济的合成路线。将来源于弗氏柠檬酸菌酪氨酸酚裂解酶的编码基因与pKK223-3载体连接,构建表达载体pKK223-TPL,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,构建了高活性的基因工程菌;研究了影响酪氨酸酚裂解酶酶活力和稳定性的关键因素,探索了减少副产物生成、提高底物转化率的催化条件。结果表明:在pH7.5、20℃条件下,控制邻苯二酚质量浓度不超过12g/L、丙酮酸钠质量浓度不超过7.5g/L、以0.4mol/L乙酸铵为氨来源、0.1mmol/LK+为激活剂时,可有效减少副产物的生成,提高酪氨酸酚裂解酶的稳定性,经过12h反应,左旋多巴产量达到122.8g/L,邻苯二酚的最大转化率达到98.7%,具有较好的工业化应用潜力。

丙戊酰酪氨酸二肽Tyr-Tyr-VPA的固相合成

以Wang树脂为固相载体,Fmoc-为α-氨基保护基,HBTU-HOBT为缩合剂,采用多肽固相合成方法合成了丙戊酰酪氨酸二肽Tyr-Tyr-VPA,粗产率86.7%,其结构经IR和ESI-MS表征。

脱氧胆酰酪氨酸的体外杀精和抗HIV活性研究

目的:检测自制的避孕型杀微生物剂的候选化合物脱氧胆酰酪氨酸(deoxycholyltyosine,DCT)体外杀精和抗HIV活性。方法:采用改良的Sander-Cramer方法,并用计算机辅助精子分析技术检测与DCT孵育后的各项精子运动参数。采用ELISA法检测核心抗原p24的含量,并采用染料转移法检测DCT抑制HIV诱导的细胞-细胞融合的活性。采用XTT法检测DCT对阴道上皮细胞VK2/E6E7的毒性。结果:DCT的体外杀精作用最小有效浓度(MEC)为1.0±0.2mg/ml;抑制HIV复制的半数有效浓度(IC50)为21.50±3.17μg/ml;不能阻止HIV病毒进入靶细胞;DCT对阴道上皮细胞系VK2/E6E7的细胞毒性较低。结论:DCT可作为避孕型杀微生物剂进行研发,预防意外妊娠和HIV的性传播。

复合氨基酸注射液(17AA)中N-乙酰-L-酪氨酸及N-乙酰-L-半胱氨酸的HPLC测定

对复合氨基酸注射液 (17AA)中含量较低的 N-乙酰 - L-酪氨酸及 N-乙酰 - L-半胱氨酸用 HPL C法进行测定。采用阳离子交换色谱柱 ,以水 (取 0 .0 5 mol/ L 硫酸 1ml置 10 0 0 ml量瓶中以水定容 ,调节 p H至 3.0 )为流动相 ,检测波长为 2 10 nm。该方法在 10～ 10 0 μg/ m l范围呈良好的线性 ,相关系数分别为 0 .9996和 0 .9999,平均回收率分别为 99.94%和 99.72 % ,RSD分别为 0 .42 %及 1.19%。

左旋多巴对帕金森病大鼠海马区酪氨酸羟化酶及α-突触核蛋白表达的影响

目的探讨左旋多巴(L-dopa)对帕金森病(PD)大鼠海马区酪氨酸羟化酶(TH)及α-突触核蛋白(α-Syn)表达的影响。方法选取96只健康雄性Wistar大鼠,按随机数字表法分为对照组、PD模型组和L-dopa干预组各32只;各组再随机分为4 d和8 d两个亚组,各16只。对PD模型组和L-dopa干预组大鼠皮下注射鱼藤酮乳液(2 mg/kg)建立大鼠PD模型,对照组皮下注射等剂量的葵花油。造模成功后对L-dopa干预组大鼠灌胃给予L-dopa干预治疗,对照组及PD模型组大鼠灌胃给予生理盐水,各组中两个亚组均分别持续4 d和8 d。采用Y型电迷宫试验检测各组大鼠的学习与记忆能力,海马区TH和α-Syn的阳性细胞计数及表达水平的检测分别采用免疫组化法及Western蛋白印迹法。结果 PD模型组大鼠的学习与记忆能力显著低于对照组,而L-dopa干预组较PD模型组明显提升(P<0.05);PD模型组及L-dopa干预组大鼠的TH阳性细胞数及表达水平均显著低于对照组,L-dopa干预组高于PD模型组,且L-dopa干预组的8 d亚组高于4 d亚组(P<0.05);PD模型组及L-dopa干预组的α-Syn表达水平均显著高于对照组,L-dopa干预组低于PD模型组,且L-dopa干预组的8 d亚组低于4 d亚组(P<0.05)。结论鱼藤酮可诱导大鼠发生PD,使其学习与记忆能力显著下降,L-dopa可通过增强海马区的TH表达水平,抑制α-Syn的表达,从而治疗PD。

脱氧胆酰酪氨酸热敏凝胶剂对家兔避孕效果和阴道黏膜刺激性研究

目的:验证脱氧胆酰酪氨酸热敏凝胶剂(DCTgel)对家兔避孕效果和阴道黏膜的刺激作用。方法:采用体外杀精试验、体内杀精试验和家兔避孕效果试验;按WHO方法评价阴道黏膜刺激性。结果:DCTgel体外杀精的ED50为0.026mg/ml;DCTgel(12.5mg、25mg)体内杀精效果与市售壬苯醇醚凝胶剂(N-9jelly,25mg)相同。家兔避孕试验表明,25mgDCTgel组与25mgN-9jelly组的避孕率相同,与基质对照组相比,有非常显著的差异(P<0.01)。阴道黏膜刺激试验结果表明,25mgN-9jelly组的总分值为6.8±0.6,25mgDCTgel为2.7±0.15,基质对照组为1.5±0.2,均在临床可接受范围。但光镜下显示,25mgN-9jelly对家兔阴道黏膜有中度刺激,但部分黏膜上皮发生点状溃疡,并伴有坏死或脱落;25mgDCTgel组仅对家兔阴道黏膜有轻度刺激,黏膜上皮完整,仅见部分黏膜上皮充血及炎症细胞浸润。结论:DCTgel与市售N-9jelly比较,避孕效果相似,而前者副作用较小,显示出具有一定的应用前景,可作为先导药物进一步进行临床前药效学研究。

人脂肪组织来源的酪氨酸羟化酶、胆碱乙酰转移酶、谷氨酸脱羧酶的表达

目的:探讨人脂肪组织来源的基质细胞(ADSCs)分化为神经细胞的神经递质关键酶TH、CHAT、GAD的表达情况。方法:分离培养人ADSCs,采用神经诱导培养基(NIM)进行诱导培养,倒置相差显微镜下连续观察细胞生长情况和形态变化,免疫组化法和免疫荧光技术检测神经递质多巴胺(DA)、乙酰胆碱(Ach)和!-氨基丁酸(GABA)合成过程中的关键酶——酪氨酸羟化酶(TH)、胆碱乙酰转移酶(CHAT)和谷氨酸脱羧酶(GAD)的表达情况。结果:①经NIM诱导后,ADSCs可分化为神经细胞。诱导分化后,1h、5h未见TH、CHAT和GAD阳性表达。1d、5d出现TH、CHAT和GAD阳性表达。②免疫荧光单标结果:诱导后的细胞内有TH、CHAT和GAD表达。免疫荧光双标结果:GAD与TH、CHAT与TH可同时表达于同一个诱导后的细胞内。结论:ADSCs可分化为神经细胞,分化后的神经细胞具有合成神经递质DA、Ach和GABA的功能。

N-乙酰-L-酪氨酸甲酯合成工艺研究

以L-酪氨酸和乙酰氯为主要原料合成了N-乙酰-L-酪氨酸,再和甲醇与氯化亚砜反应得到的氯化亚硫酸甲酯反应得到N-乙酰-L-酪氨酸甲酯,产物结构经红外光谱(IR)和1H NMR化学位移确证。通过单因素试验和正交试验结果表明,N-乙酰-L-酪氨酸甲酯合成的最佳工艺条件为物料摩尔比mol(L-酪氨酸)∶mol(氯化亚砜)∶mol(甲醇)=1∶1.3∶10,加热温度65℃,加热时间2 h。该工艺具有原料价廉易得、反应周期短及产物易分离的特点,适于工业化大规模生产。

虾夷马粪海胆硬脂酰辅酶A去饱和酶和蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆与表达

采用同源克隆方法,结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术,成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-coenzyme A desaturase,SCD)基因和蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)基因,并对其结构进行了分析,同时采用实时定量PCR方法对这两个基因在海胆胚胎不同发育时期的表达进行了研究。结果表明:SCD基因的cDNA序列全长为1 934bp(Genbank登录号为HM208174),开放阅读框819 bp,编码273个氨基酸残基,存在跨膜结构和信号肽,为分泌性蛋白;实时定量PCR检测显示,SCD基因在虾夷马粪海胆八腕期表达量最高,在2细胞时期表达量最低。PTP1B基因的cDNA序列全长为1 249 bp(Genbank登录号为HM208173),开放阅读框657 bp,编码219个氨基酸残基,存在跨膜结构和信号肽,为分泌性蛋白;PTP1B基因在海胆2细胞时期表达量最高,在八腕期表达量最低。本研究为在分子水平上探讨海胆脂代谢过程中的基因功能提供了科学依据。

酪氨酸及酪氨酰肼对小鼠的抗生育作用

酪氨酸(0.1mg或1mg/只)能使小鼠的妊娠率及胚胎数明显降低,但不能完全阻断妊娠;酪氨酰肼的抗生育作用比酪氨酸强,一定剂量可完全阻断妊娠。酪氨酸与酪氨酰肼对妊娠小鼠血中孕酮含量无明显影响。酪氯酰肼对~3H-Leu掺入小鼠妊娠子宫组织有明显抑制作用。