模拟失重对小鼠巨噬细胞RAW264.7生物学功能的影响

目的通过2D回转器回转细胞模拟失重生物学效应,探讨模拟失重对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)多种生物学功能的影响特点,为深化空间失重免疫抑制机制研究提供理论依据和数据支撑。方法将RAW264.7细胞分为对照组(NG组)、模拟失重组(SMG组),利用2D回转器模拟失重72 h后,采用CCK-8法和EdU法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞的增殖能力变化;细胞划痕实验和Transwell小室法检测巨噬细胞迁移功能的变化;探针DCFH-DA标记,倒置荧光显微镜观察和拍照检测巨噬细胞分泌活性氧(ROS)的变化。结果RAW264.7巨噬细胞模拟失重72 h后增殖受到抑制,CCK-8实验结果显示,NG组的细胞增殖速率显著高于SMG组(P<0.05);EdU染色结果显示,SMG组EdU掺入RAW264.7细胞核的量较NG组减少(P<0.01)。细胞划痕、Transwell实验检测表明72 h模拟失重对巨噬细胞的迁移能力有明显影响,与NG组相比,模拟失重后RAW264.7细胞迁移能力增强(P<0.05);探针DCFH-DA标记检测提示模拟失重对巨噬细胞分泌ROS有明显抑制作用(P<0.01)。结论回转模拟失重对RAW264.7细胞的生物学功能具有影响,表现为RAW264.7迁移运动能力增强,细胞增殖与ROS分泌能力受到抑制。

鞣花酸通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB途径抑制脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应

目的基于Toll样受体4(TLR4)-酪氨酸激酶(SRC)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)通路探讨鞣花酸的抗炎机制。方法采用不同浓度(0、0.5、5、25、50、75、100μmol·L^(-1))鞣花酸对RAW264.7巨噬细胞[或脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞]干预24 h,噻唑蓝(MTT)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适给药浓度。实验分为空白对照组,模型组(0.5 mg·L^(-1)LPS),阳性对照地塞米松组(10μmol·L^(-1)),鞣花酸(5、25、50μmol·L^(-1))给药组。Griess法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素-2(PGE2)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平;采用Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶-2(COX-2)蛋白以及TLR4-SRC/MAPK/NF-κB通路相关蛋白的表达水平。结果MTT结果筛选出鞣花酸的干预浓度为5~50μmol·L^(-1)。与空白对照组比较,模型组PGE_(2)、NO和炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著升高(P<0.01);炎症标志物iNOS、COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),说明炎症模型建立成功。与模型组比较,鞣花酸能显著抑制LPS诱导NO、PGE_(2)的产生和降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平(P<0.05,P<0.01),降低i NOS、COX-2蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性;显著抑制TLR4蛋白的表达水平以及SRC、P38、JNK、p65、IκBα蛋白的磷酸化水平,并呈浓度依赖性。但对ERK1/2蛋白磷酸化没有显示出明显的抑制作用。结论鞣花酸可能通过TLR4-SRC/MAPK/NF-κB信号通路的调控抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,具体的调控机制有待进一步研究。

文冠果叶黄酮对巨噬细胞RAW264.7细胞因子及TLR2受体的影响

通过四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法分析文冠果叶黄酮(XLF)对巨噬细胞RAW 264.7增殖活力的影响,酶联免疫吸附测定法检测巨噬细胞RAW 264.7分泌的细胞因子含量;通过XLF处理Toll样受体2(TLR2)抗体作用的巨噬细胞,研究TLR2受体对该细胞因子的介导作用。结果表明:当XLF质量浓度为320μg/mL时,巨噬细胞RAW 264.7分泌的NO、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)细胞因子最多,且与空白对照差异极显著,但都小于脂多糖(LPS);且与未加入TLR2抗体相比,加入了TLR2抗体的巨噬细胞减少了各细胞因子的分泌,且差异均极显著。XLF可促进巨噬细胞RAW 264.7的增殖及细胞因子的分泌,并且可能通过TLR2受体介导。

水芹多糖的提取及其对巨噬细胞RAW264.7免疫活性的初步研究

多糖是水芹中重要功能性成分,其分离和活性的相关研究尚未报道。该研究基于超声波辅助法从水芹中成功分离获得功能性多糖成分——水芹多糖(Oenanthe javanica polysaccharide,OJP),利用响应面法优化了OJP的分离条件,并考察了OJP对巨噬细胞RAW264.7的激活作用。响应面优化结果显示,OJP最佳分离条件为超声温度83.6℃、超声时间51 min、料液比1∶29.7(g∶mL),提取率为13.81%。单糖组成结果显示OJP由阿拉伯糖(29.94%)、半乳糖(52.48%)、葡萄糖(11.32%)以及微量木糖(2.22%)、半乳糖醛酸(3.5%)和葡萄糖醛酸(0.53%)组成。细胞实验结果表明,OJP可促进RAW264.7巨噬细胞增殖及NO产生并增强RAW264.7细胞的吞噬能力。该研究为OJP的开发与应用提供了实验基础。

丹皮酚通过TLR4/MAPK/NF-κB通路对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7损伤的保护作用

目的:探讨丹皮酚对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞炎症损伤的保护作用及其机制研究。方法:培养巨噬细胞RAW264.7,并分成空白组、LPS(1μg/mL)组、丹皮酚(240μmol/mL)组和TAK242(10μmol/mL)组。采用CCK8法检测细胞活性,倒置显微镜观察细胞形态,比色法测定细胞培养液中GSH、MDA含量,JC-1法检测线粒体膜电位,免疫荧光法检测F4/80及p-NF-κB蛋白表达分布,Western blotting检测细胞中TLR4/MAPK/NF-κB相关通路蛋白表达。结果:与空白组比较,1μg/mL LPS诱导的细胞活力为0.4972±0.061(P<0.01),接近半数抑制率。与LPS组比较,240μmol/mL丹皮酚预处理的细胞组下调p-NF-κB蛋白表达最显著(P<0.01),10μmol/mL TAK242预处理细胞组抑制TLR4蛋白表达最显著(P<0.01)。与LPS组比较,丹皮酚组细胞形态有所恢复;降低细胞培养液中MDA含量、增高GSH含量(P<0.01);线粒体膜电位结果中,丹皮酚组红光显著增强,绿光显著减弱(P<0.001);丹皮酚组F4/80及p-NF-κB蛋白表达分布显著降低(P<0.01),并下调了TLR4、p-IκB、p-p38、p-JNK、p-NF-κB蛋白表达(P<0.05)。结论:丹皮酚可改善LPS诱导的RAW264.7细胞炎症损伤,其机制可能与TLR4/MAPK/NF-κB通路相关。

狼毒大戟提取物对结核分枝杆菌感染RAW264.7巨噬细胞的免疫机制研究

目的研究狼毒大戟提取物(狼毒乙素)在结核分枝杆菌(M.tb)感染巨噬细胞中的作用及免疫机制。方法建立结核分枝杆菌H37Ra感染巨噬细胞模型,并用4%台盼蓝检测M.tb感染巨噬细胞后的活性进行检测,用不同浓度的狼毒乙素(0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.5μg/ml、12.5μg/ml)干预模型,利用Lyso-Tracker Red染色检测巨噬细胞内溶酶体发生的酸性变化;采用TNF-α和IL-6酶联免疫吸附试剂盒检测细胞因子的分泌状况。结果Lyso-Tracker Red染色结果显示,狼毒乙素能促进自噬体产生,使溶酶体的正常酸化程度增强,从而提高RAW264.7巨噬细胞的自噬能力。与空白对照组相比,在狼毒乙素干预下,炎性细胞因子TNF-α和IL-6受到抑制,并且呈剂量相关性(P<0.05);随着狼毒乙素的浓度增加,细胞因子的分泌受到抑制程度也增大,差异有统计学意义(P<0.05)。结论狼毒乙素通过诱导RAW264.7巨噬细胞的自噬,来增强RAW264.7巨噬细胞清除M.tb的能力。狼毒乙素能够降低炎性细胞因子的水平,且与剂量成明显负相关,说明狼毒乙素具有抗炎作用,可以减弱炎症细胞因子的释放。

不消化性葡聚糖体外酵解液对RAW 264.7巨噬细胞的免疫调节作用

为探究不消化性葡聚糖(indigestible glucans,IGs)体外肠道菌酵解液的免疫调节活性,采用厌氧发酵模型利用健康人体粪便菌群分别对6种IGs(大麦β-葡聚糖、海带多糖、酵母β-葡聚糖、茯苓多糖、抗性淀粉和聚葡萄糖)进行24 h体外酵解,除菌过滤获得IGs酵解液,对pH值和短链脂肪酸含量进行测定。并以RAW 264.7巨噬细胞为研究对象,分为正常组、阳性组和IGs酵解液组,采用CCK-8试剂盒测定细胞活力,一氧化氮(nitric oxide,NO)检测试剂盒测定细胞NO释放量,流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,酶联免疫吸附测定法测定细胞因子分泌量。结果表明,相比于正常组,6种IGs的24 h酵解液均显著提高了RAW 264.7巨噬细胞活力、NO释放量、ROS产生量和小鼠肿瘤坏死因子α分泌量。各IGs 24 h肠道菌酵解液对RAW 264.7巨噬细胞均具有免疫调节的作用。

5-氨基酮戊酸光动力疗法对小鼠RAW264.7巨噬细胞株吞噬活性和活性氧自由基的影响

目的探讨5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinicacid photodynamic therapy,5-ALA-PDT)对RAW264.7细胞吞噬活性和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的影响。方法细胞实验研究用灭活痤疮丙酸杆菌诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,产生炎症细胞模型,给予不同浓度的5-ALA孵育RAW264.7细胞,并给予16 J/cm^2红光照射。采用中性红法检测巨噬细胞的吞噬活性,荧光显微镜观察细胞内活性氧离子的荧光强度,2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法(dihydrochloride acetyl acid dichloride,DCFH-DA)检测活性氧自由基水平。结果模型组吞噬活性比空白组高,随着5-ALA浓度升高,吞噬活性降低,呈剂量依赖性。荧光显微镜下5-ALA 0.12 mmol/L组细胞内有大量红色荧光。随着5-ALA浓度升高,ROS水平升高,呈剂量依赖性。结论 5-ALA-PDT可对RAW264.7细胞吞噬活性和活性氧自由基产生影响,可能影响5-ALA-PDT的疗效。

连接蛋白43在吡啡尼酮促进小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化中的作用

目的探讨连接蛋白43(connexin 43,Cx43)是否能够调节吡啡尼酮(pirfenidone,PFD)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M2型极化。方法将体外培养的对数生长期小鼠RAW264.7巨噬细胞分为对照组(Control组)、PFD组、PFD+Cx43特异性阻断剂Gap19组(PFD+Gap19组)、吡啡尼酮+阴性慢病毒对照组(PFD+NC组)、吡啡尼酮+Cx43过表达慢病毒组(PFD+OE组)。采用慢病毒转染技术,加入含有过表达慢病毒的培养基,使Cx43在巨噬细胞中过表达。采用Western blot技术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Cx43和M2型极化标记物CD206、Arg-1的蛋白表达水平,采用倒置荧光显微镜观察小鼠RAW264.7巨噬细胞I型精氨酸酶(arginase1,Arg-1)和CD206的蛋白表达和定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测Cx43,Arg-1和CD206的RNA表达水平。结果PFD组中的Cx43蛋白表达与Control组相比降低;PFD组中的M2型极化标志物CD206和Arg-1与Control组相比大幅升高;与PFD组相比,在PFD+Gap19组中Arg-1和CD206的表达均显著升高;与PFD组相比,在PFD+NC组中Arg-1和CD206的表达无明显改变。与PFD+NC组相比,PFD+OE组中Arg-1和CD206的表达均显著降低。结论PFD可以通过下调Cx43促进小鼠RAW264.7巨噬细胞向M2型极化。通过Gap19和过表达慢病毒调节Cx43的表达,也可调节巨噬细胞M2型极化。

鱼腥草素钠对脂多糖诱导单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的探讨鱼腥草素钠(SH)对脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用及其机制。方法实验分为空白对照组(等体积培养基),模型组(等体积培养基),SH低、中、高剂量组(1.25,5,10μmol/L),以含不同浓度SH的常规培养基培养细胞2 h,后4组细胞加入LPS继续培养24 h。收集细胞上清液,测定一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及前列腺素E_(2)(PGE_(2))的水平;提取细胞总蛋白,采用Westernblot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)蛋白及核因子-κB(NF-κB)通路相关蛋白(NF-κB-P-P65蛋白和P-IκB-α蛋白)的表达水平。结果与模型组比较,SH中、高剂量组细胞NO水平显著降低,SH低、中、高剂量组细胞TNF-α,IL-6,PGE_(2)水平和COX-2,NF-κB-P-P65,P-IκB-α蛋白表达水平均显著降低,SH中、高剂量组细胞iNOS蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论SH能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子的分泌,其作用机制与抑制炎性蛋白iNOS和COX-2的表达及NF-κB通路相关蛋白的磷酸化有关。

异荭草苷通过MAPK/FoxO信号通路减轻LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应

为了研究异荭草苷(Isoorientin,ISO)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症反应的影响及其机制,将对数生长期的RAW264.7细胞随机分为对照组、模型组(LPS 1μg·mL^(-1))和异荭草苷(ISO 2.5~40μg·mL^(-1)+LPS)给药组。各组细胞培养24 h后,MTT法检测ISO对RAW 264.7细胞毒性,Griess法检测细胞培养液中一氧化氮(NO)的含量,ELISA法检测细胞培养液中TNF-α的含量,q RT-PCR方法检测环氧合酶2(COX-2)m RNA的表达水平,蛋白质印迹分析法测定细胞中COX-2、JNK、p-JNK、p38、p-p38、FoxO1和FoxO3蛋白的表达。结果表明,与LPS模型组比较,ISO显著抑制LPS诱导的TNF-α(P<0.001)和NO(P<0.01)的产生,且未见其细胞毒性。此外,ISO以剂量依赖的方式显著抑制RAW 264.7细胞COX-2基因(P<0.001)和蛋白(P<0.05)的表达。蛋白质印迹分析显示,ISO显著抑制MAPK信号通路中p-JNK和p-p38的磷酸化,并减少Fox O1/3的核转位。综上所述,ISO可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应,其作用机制可能与其在MAPK/FoxO信号通路中发挥调节作用有关。

乌头酸脱羧酶1对BCG诱导巨噬细胞炎症反应的调控作用研究

旨在探究乌头酸脱羧酶1(aconitate decarboxylase 1,ACOD1)对减毒牛分枝杆菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的调控作用。基于小干扰RNA技术构建ACOD1敲减模型,采用Western blot、qRT-PCR、免疫荧光等技术检测BCG感染巨噬细胞RAW264.7后细胞内ACOD1、细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10、COX2、iNOS以及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白的表达变化。结果显示,BCG感染巨噬细胞RAW264.7后以时间和浓度依赖性方式显著上调ACOD1及促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX2、iNOS的表达,下调抑炎细胞因子IL-4、TGF-β的表达(P<0.01);si-ACOD1结合BCG感染会显著下调促炎细胞因子表达(P<0.01),同时也会下调TLR4/MyD88/NF-κB通路相关蛋白TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65的表达。综上,ACOD1可能通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与调控BCG引起的炎症反应。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)的培养及其在诱导破骨细胞中的应用

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)是通过Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后得到的细胞株。RAW264.7细胞在医学研究中应用十分普遍:它是许多白血病相关研究模型的常用细胞株;在微生物学、免疫学等研究中也十分常用;同时也是小鼠源性破骨前体细胞,可通过特定细胞因子的诱导在体外获得成熟破骨细胞,因此也成为许多骨骼疾病研究的体外模型。但RAW264.7细胞形态和分化状态多变,在实际培养中较难把握,给科研工作带来了一定困难。科研工作者在RAW264.7细胞的培养方法、细胞的形态及分化状态等方面始终观点不一,对于用RAW264.7细胞在体外诱导获得破骨细胞的方法也有许多差别。本文结合文献资料及实践,探索了RAW264.7细胞的培养条件,冻存、复苏、传代方法,以及用核因子κB受体活化因子配基(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导其成为成熟破骨细胞的技术关键;旨在总结RAW264.7细胞的培养及诱导其分化为破骨细胞的经验教训,探讨RAW264.7细胞的培养和在体外用RANKL诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞的方法、技巧,供广大科研工作者借鉴。

大粒车前子多糖对脂多糖刺激RAW264.7巨噬细胞的免疫调节作用

采用脂多糖构建RAW264.7巨噬细胞炎症模型,研究大粒车前子多糖的抗炎作用。培养巨噬细胞RAW264.7,利用脂多糖构建细胞炎症模型,中性红吞噬实验检测细胞吞噬活性;酶联免疫吸附法检测车前子精制多糖(Plantago asiatica L.crude polysaccharide,PLCP)处理前后细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和IL-6的分泌量,Griess反应测定RAW264.7细胞释放NO水平。结果表明,PLCP可显著抑制RAW264.7炎症细胞的吞噬活性,降低炎症细胞因子TNF-α、IL-10和IL-6的分泌量及NO的释放量。

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用

目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCI、II类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。

牡丹花蕊黄酮对H_2O_2诱导RAW264.7巨噬细胞损伤的保护作用

目的:研究牡丹花蕊黄酮对H_2O_2诱导损伤的RAW264.7巨噬细胞的保护作用。方法:实验分为空白组、H_2O_2损伤组、VC对照组和牡丹花蕊黄酮低、中、高剂量组。应用H_2O_2建立RAW264.7巨噬细胞氧化损伤模型,噻唑蓝法测定细胞存活率,试剂盒法测定细胞和细胞培养液中谷胱甘肽和丙二醛含量及过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、乳酸脱氢酶活力。结果:牡丹花蕊黄酮的质量浓度在10～30μg/mL范围内时,可显著促进RAW264.7巨噬细胞的增殖(P<0.05)。与H2O2损伤组相比,牡丹花蕊黄酮各剂量组能够提高细胞及细胞培养液中总抗氧化能力,谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物酶、过氧化氢酶活力以及还原型谷胱甘肽含量,降低细胞及细胞培养液中丙二醛含量,提高细胞内乳酸脱氢酶的水平。结论:牡丹花蕊黄酮可以促进RAW264.7巨噬细胞的增殖,提高H_2O_2损伤的RAW264.7巨噬细胞的抗氧化能力,且存在剂量依赖效应。

姜黄素促进RAW264.7源性M1巨噬细胞向替代激活M2表型极化

目的观察姜黄素对LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)极化的影响及机制。方法不同浓度姜黄素(6.25、12.5、25μmol/L)干预LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)12h,同时再加入20μmol/L GW9662与25μmol/L姜黄素共同干预LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)12h,采用Real-time PCR、ELISA及Western blot方法检测IL-1β、IL-6和M2表型标志分子KLF4、FIZZ1、MGL1、PPARγ的表达,及阻断PPARγ后KLF4和FIZZ1的表达。结果不同浓度姜黄素均能上调LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)的M2标志分子的表达,并且抑制炎症因子IL-1β和IL-6的分泌;阻断PPARγ后,RAW264.7巨噬细胞源性M1表型巨噬细胞表达M2标志分子下调。结论姜黄素通过活化PPARγ促进LPS和IFNγ诱导的RAW264.7巨噬细胞(M1)向M2表型极化。

木犀草素对活化的RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的炎症是机体的一种防御性反应,但过度的炎症又会导致机体损伤。文中旨在探讨木犀草素对LPS和IFN-γ诱导的RAW264.7细胞炎症因子表达的影响及机制。方法将细胞分为对照组、LPS+IFN-γ组、木犀草素低、中、高剂量组。对照组:不加药的RAW264.7细胞;LPS+IFN-γ组:终浓度为10 ng/m L LPS+20 ng/m L IFN-γ刺激细胞M1极化;木犀草素低剂量组:LPS+IFN-γ与终浓度为5μmol/L的木犀草素同时刺激;木犀草素中剂量组:LPS+IFN-γ与10μmol/L的木犀草素共同刺激;木犀草素高剂量组:LPS+IFN-γ与20μmol/L的木犀草素共同刺激。激光共聚焦显微镜观察细胞形态的变化;Real time-q PCR检测诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、IL-1β和IL-6基因的表达,ELISA检测上清TNF-α和IL-6的分泌,Western blot检测蛋白通路phospho-STAT3(ser727)(p-STAT3)的变化。结果活化的RAW264.7细胞形态发生明显变化,与对照组比较,其余4组i NOS、IL-1β、IL-6均降低(P<0.05);与LPS+IFN-γ组i NOS(98.91±10.65)比较,木犀草素高剂量组(29.52±3.07)明显降低(P<0.01);与LPS+IFN-γ组IL-1β(110.69±4.12)比较,木犀草素中剂量组、木犀草素高剂量组(78.38±8.65、41.59±6.80)明显降低(P<0.05),与LPS+IFN-γ组IL-6(394.10±33.47)比较,木犀草素低、中、高剂量组(177.51±19.28、106.14±5.63、27.15±1.26)明显降低(P<0.05)。LPS+IFN-γ能诱导RAW264.7细胞M1表型的p-STAT3(ser727)上调,与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组p-STAT3明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组M1源性的p-STAT3-ser表达下调(P<0.05),并呈剂量依赖性。与对照组比较,M1、木犀草素低、中剂量组IL-6、TNF-α表达明显升高(P<0.05),与LPS+IFN-γ组比较,木犀草素低、中、高剂量组IL-6、TNF-α表达明显下调(P<0.05)。其中IL-6呈浓度依赖性,TNF-α不呈浓度依赖性。结论木犀草素可能通过下调p-STAT3抑制RAW264.7细胞致炎因子的表达,从而发挥抗炎作用。

人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡

目的探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制。方法体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据最佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)+3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组。采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化。结果不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调。结论人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用。

慢性高糖抑制小鼠RAW264.7巨噬细胞AKT磷酸化并促进其Ml型极化

目的研究慢性高糖对小鼠巨噬细胞的影响及机制.方法以正常生长液和含(40、60)mmol/L葡萄糖的生长液培养小鼠RAW264.7巨噬细胞1、3、5、7 d,相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞增殖能力,Western blot法检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)和IL-1O蛋白水平,ELISA检测培养细胞上清液IL-Iβ和IL,-10分泌量;实时定量PCR法检测细胞蛋白激酶B(AKT)mRNA水平,Western blot法检测细胞AKT、磷酸化的AKT(p-AKT)蛋白水平.结果60 mmol/L葡萄糖处理1 d即出现较多长梭形细胞,可见伸展的伪足,且随时间延长数量增加、体积变大;处理1 d即明显抑制细胞增殖,随时间延长抑制效果有所改善;处理3,5,7d后,IL-1β蛋白水平增加、IL-10蛋白水平降低;处理1 d后IL-1β分泌显著增加,但处理3d后IL-10分泌显著减少且随时间延长进一步减少;处理3,5,7 d后,AKT蛋白磷酸化被抑制,但AKT mRNA水平未见明显变化.40 mmol/L葡萄糖处理在一定程度上发挥作用,但不如60 mmol/L葡萄糖显著和稳定.结论长期高糖刺激诱导巨噬细胞向促炎性M1型转变,诱发巨噬细胞的持续慢性炎症反应,其机制可能与抑制AKT蛋白磷酸化激活有关.